一种l-草铵膦的酶-化学催化去消旋化制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及L-草铵膦的酶-化学催化去消旋化制备方法，属于酶法制备手性农药
技术领域。
【背景技术】
[0002] 德国赫斯特(Hoechst)公司开发的草铵膦(Glufosinate)是一种谷氨酰胺合成酶 (GS)抑制剂，能抑制GS所有已知的形式，导致植物体内氮代谢紊乱、氨的过量积累、叶绿体 解体，从而使光合作用受抑，最终导致植物死亡。草铵膦具有很强的除草活性，几乎能有效 防除各种供试杂草，对农作物安全，活性高，杀草谱广，药害小，是目前转基因抗性作物理想 的除草剂。草铵膦同时也是一种优良的杀菌剂。
[0003] 草铵膦含一个手性中心，其L-对映体的除草活性是消旋体的2倍，不易产生抗药 性，产品寿命周期比消旋体更长。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可 使草铵膦的使用量降低50%，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有 十分重要的意义。
[0004] L-草铵膦的制备方法主要包括化学法和生物法。
[0005] ( - )化学法。赫斯特公司（US5767309)采用不对称转换法，以奎宁为手性拆分剂拆 分DL-草铵膦制备L-草铵膦。该方法使用昂贵的手性拆分剂，经历成盐、诱导结晶、解盐、重 结晶等复杂步骤。文献报道了大量的L-草铵膦化学不对称合成法(毛明珍等，农药，2014,53
[6] :391-393)。化学不对称合成法采用价格昂贵的手性源、手性助剂或手性催化剂，通常步 骤冗长，合成路线复杂，反应条件苛刻，产品收率和光学纯度低，生产成本高，不适合L-草铵 膦的工业化生产。
[0006] (二)生物法。生物法包括生物不对称合成法和生物拆分法(楼亿圆等，现代农药， 2009,8(3): 1-10)。生物不对称合成法主要包括氨基酸脱氢酶法和转氨酶法。氨基酸脱氢 酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，采用谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶体系制 备L-草铵勝，收率仅为25%，ee值为89.2%(Fang JM et al. J Chem Soc, Perkin Trans I， 1995:967-978 .)。该方法中不仅谷氨酸脱氢酶的利用效率非常低，产物收率低，而且辅酶 NADH需再生，难以在工业化生产中应用。转氨酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为氨 受体，L-谷氨酸或L-天冬氨酸为氨供体，通过转氨化反应制备L-草铵膦，转化率达到75%，ee >99%(US5153355)。由于转氨化是一个可逆反应，存在两个L-氨基酸和两个α-酮酸的反应平 衡，L-草铵膦不仅收率低，而且也增加了分离难度。生物拆分法主要包括以DL-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺为原料的L-酰胺酶拆分法，以Ν-乙酰(苯乙酰)-DL-草铵膦为原料 的酰化酶拆分法，以2-氨基-4-(羟基甲基磷酰基）丁腈为原料的腈水解酶拆分法（CN 103275896 A)等。生物拆分法的理论收率仅为50%。通常情况下，生物拆分法需要以衍生的 DL-草铵膦为原料，涉及无效对映体的化学消旋和循环拆分。
[0007] 相比于化学法，生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离 纯化的优点，是实现L-草铵膦工业化生产最具潜力的方法。开发一种简捷、高效、绿色的生 物制备方法将是今后生产L-草铵膦的重要突破口和发展方向。
【发明内容】
[0008] 鉴于此，本发明的目的是提供一种L-草铵膦的酶-化学催化去消旋化制备方法。采 用"一锅煮"反应方式，以未经衍生的DL-草铵膦为原料，利用固定化D-氨基酸氧化酶对映选 择性催化DL-草铵膦中的D-对映体氧化脱氢为2-亚氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵 膦完全保留。利用钯碳-甲酸铵化学催化氢转移体系将2-亚氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸 原位还原为DL-草铵膦，通过生物氧化-化学还原循环实现DL-草铵膦的去消旋化，反应过程 中形成的过氧化氢利用过氧化氢酶原位分解去除，从而以高的收率和高的光学纯度制备L-草铵膦。
[0009] 技术路线如下：
本发明包括去消旋化步骤和L-草铵膦分离步骤，具体方法步骤如下： 1)去消旋化反应，在lmol/L的甲酸铵溶液(pH6.5)中加入DL-草铵膦，搅拌溶解，配制的 溶液中DL-草铵膦的浓度为10~20%(w/v)。然后加入固定化D-氨基酸氧化酶、过氧化氢酶和 钯碳，连续通入氧气，30°C下搅拌反应直至D-对映体反应完全； 其中，固定化D-氨基酸氧化酶(酶活为50u/g)与DL-草铵膦的质量比为0.1~0.2:1，过氧 化氢酶(酶活为50000u/ml)与固定化D-氨基酸氧化酶的活性比为100~200:1，钯碳（10%)与 固定化D-氨基酸氧化酶的质量比为1~2:1，搅拌反应的反应时间为12~24h。
[0010] 反应过程监测和L-草铵膦光学纯度采用手性液相色谱法测定。手性液相色谱柱： Crownpak CR(+)(4.0X150mm，5μηι)，流动相：高氯酸溶液(pHl · 5 )，流速:0 · 5ml /min，检测： UV210nm。对映体色谱峰定位采用标准品对照。L-草铵膦的光学纯度用对映体过量值(ee)表 不。
[0011] 2)L-草铵膦分离，经步骤1)反应后的反应液过滤去除固定化D-氨基酸氧化酶和钯 碳，再将滤液用28%氨水调节pH至8.0，80°C下减压浓缩至体积为滤液的1/5，冰浴冷却，析出 固体，烘干得L-草铵膦。
[0012] 与现有的L-草铵膦制备方法相比，本发明提出的酶-化学催化去消旋制备方法具 有以下优点：1)工艺简单。双酶反应和化学催化氢转移反应在同一反应体系中进行。高浓 度DL-草铵膦不经衍生，直接作为固定化D-氨基酸氧化酶的反应底物。中间产物2-亚氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸不经分离，直接原位转化为DL-草铵膦，用于连续转化。反应过程 中产生的过氧化氢利用过氧化氢酶原位分解，最大程度减小了过氧化氢对D-氨基酸氧化酶 活性的的抑制作用和对2-亚氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的分解作用。2)分离过程简单。 产物流中仅含L-草铵膦和少量的副产物4-(羟基甲基膦酰基)-2-丁酮酸和3-(羟基甲基膦 酰基)-丙酸，只需采用简单的浓缩、结晶方法即可以高的收率和高的光学纯度实现L-草铵 膦的分离。3)成本低廉。固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C催化剂均为多相催化剂，可回收重