含抗稻瘟病基因重组dna片段植株的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及遗传学、基因组学和分子育种领域，具体地说，涉及全基因组选择育种 技术以及利用该技术快速精确选育含抗稻瘟病基因重组DNA片段植株的方法。
【背景技术】
[0002] 稻瘟病是水稻最严重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失占 11 %~30 %，因此稻瘟病及其抗性的研究显得尤为重要。随着对稻瘟病研究的逐步深入，许 多水稻抗稻瘟病基因 DNA片段相继被定位和克隆。其中，水稻第6染色体的Pi2区间被定 位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50,该区间包含一个稻瘟病 抗性基因的基因簇（Dai 等，2010 ;Qu 等，2006 ;Wang 等，2012 ;Zhou 等，2006 ;Xiao 等，2012 ; Liu 等，2002 ;Liu 等，2011 Jiang 等，2012 ;Zhu 等，2012 ;Deng 等，2006)。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株的选育方法，包括 以下步骤：
[0004] (1)以水稻'空育13Γ为轮回亲本，含抗稻瘟病基因 DNA片段的'K22'为供体 亲本进行杂交和回交，获得BC^代；利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记RM19814、 RM19835对BC^代进行抗稻瘟病基因 DNA片段单侧同源重组片段筛选，并用水稻全基因组 育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
[0005] (2)选择背景回复较好的重组单株与受体亲本'空育13Γ进行回交，获得BC2Fi代， 利用正向选择标记Pi2_4对其进行检测，选择含有抗稻瘟病基因 DNA片段的重组单株，然后 用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
[0006] (3)选择背景回复好的重组单株再次与受体亲本'空育13Γ进行回交，获得BC3Fi 代，利用正向选择标记Pi2_4和负向标记RM19814、RM19835对BCR代进行抗稻瘟病基因 DNA片段另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景 选择，筛选到导入目标片段小，且背景回复好的重组单株；
[0007] (4)选中的重组单株自交一次，获得BC3F2代；利用正向选择标记Pi2_4对BC 3F2代 进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，最终获得目标基因 组DNA片段纯合，且背景完全回复的含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株；
[0008] 其中，所述抗稻瘟病基因重组DNA片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
[0009] 本发明还提供利用上述方法获得的一个抗稻瘟病基因重组DNA片段，该片段两侧 的同源重组片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0010] 本发明还提供用于检测上述抗稻瘟病基因重组DNA片段的方法。根据该片段两侧 的同源重组片段的核苷酸序列，分别设计特异性PCR扩增引物，以待测水稻基因组为模板， 进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。
[0011] 优选地，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。
[0012] 用于扩增及检测SEQ ID No. 1所示同源重组片段的引物组合为：
[0013] 组合 I
[0014] 扩增引物：
[0015] A08X1 IF: 5 ' -TAAGTAGCATGATCACGACGGTTGA-3 '
[0016] A08X11R:5' -CACATCAGTAGTGTTGACGCTTG-3'
[0017] 测序引物：
[0018] A08X1 IF: 5，-TAAGTAGCATGATCACGACGGTTGA-3 '
[0019] 组合 II
[0020] 扩增引物：A08X48F: 5，-CATCCTCGACCGTTTGCGA-3 '
[0021] A08X48R: 5 ' -TGCTTCAGGGTGATGGGGA-3 '
[0022] 测序引物：A08X48F: 5，-CATCCTCGACCGTTTGCGA-3 '
[0023] 组合 III
[0024] 扩增引物：A08X47F: 5 ' -CAGATAACTAAACAGACA-3 '
[0025] A08X47R: 5 ' -CGATCCGGTGCTTCGTGA-3 '
[0026] 测序引物：A08X47R:5' -CGATCCGGTGCTTCGTGA-3'
[0027] 组合 IV
[0028] 扩增引物：A08X20F: 5，-GAGCAGCACCATGATCACCA-3，
[0029] A08X20R: 5，-TGTTAGTTAGCCCTCCTGTTGAT-3，
[0030] 测序引物：A08X20F: 5，-GAGCAGCACCATGATCACCA-3，。
[0031 ] 以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测 序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID No. 1序列一致或互补，则待测样 品中含有SEQ ID No. 1所示同源重组片段。
[0032] 用于扩增及检测SEQ ID No. 2所示同源重组片段的引物组合为：
[0033] 组合 V
[0034] 扩增引物：A〇8)Q2F:5, -TGTATGCCACCACCTCTTCCT-3，
[0035] A08X12R:5' -TATTCACCGTAAGATCAAAACCA-3'
[0036] 测序引物：A08)(12F:5' -TGTATGCCACCACCTCTTCCT-3'
[0037] 组合 VI
[0038] 扩增引物：A08X28F: 5，-GGAGTACCTAAGTACATGCA-3，
[0039] A08X28R: 5，-TGGCTCCATAGCAGTCACCAGTA-3 '
[0040] 测序引物：A08X28F: 5，-GGAGTACCTAAGTACATGCA-3 '
[0041] 组合 VII
[0042] 扩增引物：A08X29F: 5，-GTACTGCTATTCACGTGAGA-3，
[0043] A08X29R: 5 ' -TGTACCCATTATTTTGGACCATT-3 '
[0044] 测序引物：A08X29F: 5，-GTACTGCTATTCACGTGAGA-3 '
[0045] 组合 VIII
[0046] 扩增引物：A08X30F: 5，-GGAAGGTTAGGTGGGATGCA-3 '
[0047] A08X30R: 5 ' -GCTCCTACAAAAGCTCCTAGATC-3 '
[0048] 测序引物：A08X30F: 5 ' -GGAAGGTTAGGTGGGATGCA-3 '
[0049] 组合 IX
[0050] 扩增引物：A08X3 IF: 5，-TGTAGGAACACTAATGGACT-3 '
[0051] A08X31R:5' -TTCGTAGTATGACTCTAAGTC-3'
[0052] 测序引物：A08X31F: 5' -TGTAGGAACACTAATGGACT-3'。
[0053] 以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测 序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID No. 2序列一致或互补，则待测样 品中含有SEQ ID No. 2所示同源重组片段。
【附图说明】
[0054] 图1为本发明实施例1中A08-4水稻Rice60K全基因组育种芯片检测结果；其中， 横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位 置[以兆碱基（Mb)为单位]，图中第6号染色体上黑色线条显示区段即为导入一个抗稻瘟 病基因重组DNA片段的RecA08-4。
[0055] 图2为本发明实施例2中RecA08_4抗稻瘟病基因重组DNA片段上游同源重组片 段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，图中A08-4为获得的新品系， KY131为受体亲本'空育13Γ，'K22'为供体亲本。
[0056] 图3为本发明实施例2中RecA08_4抗稻瘟病基因重组DNA片段下游同源重组片 段测序比对结果。
[0057] 图4为本发明实施例2中RecA08_4抗稻瘟病基因重组DNA片段两侧同源重组片 段的结构图；其中，（A)为基因上游同源重组片段结构图；(B)为基因下游同源重组片段结 构图，上方碱基为供体'K22'的SNP或InDel标记，下方碱基为受体'空育13Γ的SNP或 InDel标记。灰色区段为来源于'空育13Γ基因组区段，黑色区段为来源于'K22'基因组 区段，白色区段为同源重组区段，横坐标为片段长度，以碱基对数目（bp)为单位。
[0058] 图5为本发明实施例3中A08-4稻瘟病抗性室内鉴定结果；图中所示叶片依次为： ⑷稻瘟病感病品种丽江新团黑谷；(B)原品种'空育131' ；（C)改良新品系A08-4 ;⑶稻 瘟病抗病品种谷梅4号。
【具体实施方式】
[0059] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0060] 本发