用于快速检测食用向日葵杂交种sh363真实性的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于鉴定农作物种子真实性和品种纯度领域，具体涉及一种基于SSR分子 标记技术建立的可快速检测向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 向日葵（Helianthus annuusL.)属菊科（Composicae)向日葵属的双子叶植物，原 产自北美，通过人工培育形成了具有很多不同遗传多态性的品种，具有耐盐碱、耐干旱、耐 瘠薄、适应性强的特点，含油量丰富，油脂中亚油酸含量高，是世界第二大油科作物。向日葵 的品种繁多，其中食用向日葵由于不饱和脂肪酸含量高，尤其是亚油酸和α-麦胚酚（维生 素 Ε的一种）含量高，不仅营养丰富，还可有效防治心血管疾病，广受人们喜爱。食用向日 葵品种丰富，有数百个地方品种散步在全国各地。随着向日葵育种技术的不断发展和杂交 品种的广泛推广，开发出了更多的具有优势的食用向日葵杂交种，但由于食用向日葵品种 的繁多以及不法商贩贩卖伪劣假冒的食用向日葵品种，使得食用向日葵杂交种的保护受到 严重的破坏，损害了广大的种植户的利益，因此食用向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴 定已越来越成为食用向日葵新品种保护以及保护种植户利益的必要手段。
[0003] 传统的向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定方法依靠田间小区鉴定方法，在苗 期、蕾期、花期、灌浆期以及对收获后的种子等进行观测鉴定，主要依据向日葵的株、叶、花、 种子的特征特性加以评价和判断。但上述鉴定方法存在如下缺陷：（1)受到经验的限制， 没有完全一致的评判标准；（2)在向日葵生长期间的鉴定还容易受到气候与栽培条件的影 响，引起误差或误判；(3)需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差，对市场与生 产的指导不及时，难以避免给生产上带来的损失。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实 性与品种纯度鉴定。分子标记技术作为一种植物基因组特征分析手段，是继形态标记、细胞 标记和生化标记之后发展出的一种新的较理想的基因标记形式。分子标记鉴定技术是以 DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可以反映生物的个体和群体特征。由 于分子标记可以直接反映 DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，可以用于鉴定 种子的真实性与品种纯度。
[0005] SSR(simple sequence repeats)是一种常用的标记技术，具有数量丰富、多态性 高、共显性遗传、扩增稳定、易于检测等方面的优点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、 遗传多样性、标记和定位基因以及分子标记辅助方面的应用。SSR技术是基于微卫星DNA， 其是一段核酸简单重复序列，广泛存在于真核生物的基因组中，微卫星DNA重复单位的重 复次数出现不同，在不同基因型间同一基因座位的微卫星DNA往往表现为长度等的差异， 形成了丰富的多态性。SSR的核心单位一般由2-6个核苷酸组成，两侧一般是保守序列， 可以根据微卫星两端的单拷贝序列设计特异性引物，利用PCR技术扩增每个位点的微卫星 DNA序列，通过电泳分析微卫星DNA多态性，进而达到区别不同品种的目的。微卫星标记通 常具有共显性的特点，F1杂交种具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持 性遗传背景基本一致，只在不育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择 DNA分子标记进行分析，从而实现植物品种的有效地区别和鉴定。SSR标记已成为现阶段用 于鉴定种子纯度的常用方法，已广泛应用于玉米、水稻、大豆的新品种纯度鉴定。但是目前 在食用向日葵杂交种使用SSR分子标记技术鉴定其真实性和纯度的报道鲜有，建立一套适 于食用向日葵杂交种真实性和纯度鉴定的SSR分子标记技术具有重要意义，可以克服传统 的田间小区种植鉴定所带来的不足。
[0006] SH363是北京三瑞农业科技有限公司2010年选育的食用向日葵晚熟杂交种，其亲 本组合为A436XR1843,生育期为115-125天；幼苗绿茎，生长整齐，长势旺；叶片平展，卵圆 形，叶片数30片左右，叶色深绿，叶片大，株型整齐清秀。开花期一致，舌状花黄色。花盘 直径20厘米左右，植株弯曲度较大，株高220厘米左右，茎杆粗壮韧性极好，抗倒伏能力极 强；平均单盘粒数多，结实率85 %左右，粒长2. 0-2. 3厘米，千粒重185g左右；籽粒为黑色 白边有不规则白色条纹，洁净，口感香甜，商品性极好，籽粒饱满，籽仁率可达到50-55%。 该品种成熟时叶片干净，抗霜霉病，抗黄萎病；菌核病的发生率很低。该品种产量三要素协 调，丰产性良好，一般亩产340公斤左右。适合中高肥力的田块种植。田间表现整齐，高抗 病，抗倒伏，耐盐碱。为保证该优质品种的最大经济效益及其产业化的发展，需要一种可高 效准确的检测试剂盒来快速鉴定所述食用向日葵杂交种SH363的真实性和品种纯度，加快 杂交种的质量检测进程。
【发明内容】
[0007] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可快速鉴定食用向日葵杂交种 SH363真实性的试剂盒，所述试剂盒使用方便、快捷，能够在短时间内对大量的待测食用向 日葵杂交种SH363样品进行快速鉴定，测定结果准确稳定可靠。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH363 真实性的试剂盒，所述试剂盒包括各自独立包装的引物液、PCR反应液和DNA聚合酶部分， 其中，所述引物液部分含有如下引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079中 的至少一种：
[0009] SR-366-F: 5，-AACCAACTGAGCATTCTTGTGA-3，，
[0010] SR-366-R: 5，-GCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA-3，；
[0011] SR-495-F: 5 ' -CCAGGATTAGGTAGCTTAGTTCG-3 '，
[0012] SR-495-R: 5 ' -GCGATCTGAGGTTGACTCGT-3 ' ；
[0013] SR-1067-F: 5 ' -CGTCAACTAATGCTGTCCTGATG-3 '，
[0014] SR-1067-R:5,-TCGGATATGATGCTGCTAAAGGT-3,；
[0015] SR-1079-F: 5 ' -TACGACTGACGATTCCATTTCTC-3 '，
[0016] SR-1079-R: 5' -AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT-3'。
[0017] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，其特征在于，所 述引物液部分中的引物为引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079中的任 意两种。
[0018] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，所述PCR反应液 部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs以及ddH20。
[0019] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，所述DNA聚合酶 为Taq DNA聚合酶。
[0020] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，每支所述试剂盒 的配方为：
[0021] 引物液，0·2μΜ，1μL;
[0022] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ;
[0023] 10 X 含 Mg2+ 扩增缓冲液，2mM，2· 5 μ L ;
[0024] dNTPs, 2. 5mM, 2 μ L ；
[0025] ddH20,17μ L〇
[0026] 本发明提供了一种利用所述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的 方法，包括如下步骤，
[0027] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH363、以及标准向日葵种子A436和R1843 种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA ;
[0028] (2)取步骤⑴获得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的试剂盒分 别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
[0029] (3)分别将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行凝胶电泳处理，获得所述待测 食用向日葵杂交种SH363以及其亲本标准向日葵A436和R1843的电泳图谱；
[0030] (4)对比上述杂交种SH363以及其亲本标准种子A436和R1843的电泳图谱，若所 述杂交种SH363同时具有其亲本标准种子A436和R1843的特征谱带，则判定所述待测食用 向日葵杂交种SH363为真实；反之，为假。
[0031] 所述的快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的方法，所述DNA模板的加入量 为30ng配制1 μ L。
[0032] 所述的快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的方法，所述步骤（2)中，PCR扩 增程序如下：95°C预变性2min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每个循环退 火温度下降1°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进行30个循环，最终 72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用。
[0033] 本发明提供了一种所述的试剂盒在鉴定优质食用向日葵杂交种SH363真实性领 域中的用途。
[0034] 本发明提供了一种所述的快速检测优质食用向日葵杂交种SH363的方法在鉴定 食用向日葵杂交种SH363真实性领域中的用途。
[0035] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0036] (1)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，通过 大量引物筛选研究，筛选出了引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079，使用 上述引物中的至少一种对待测食用向日葵杂交种SH363进行品种的鉴定，电泳图谱清晰， 在短时间内进行大量的食用向日葵杂交种SH363的品种鉴定，鉴定结果稳定、准确可靠； [0037] (2)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH363真实性的试剂盒，操作 步骤简单、易操作，可以高效的对食用向日葵杂交种SH363的品种鉴定，检测结果准确。
【附图说明】
[0038] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0039] 图1是本发明实施例1的食用向日葵杂交种SH363的电泳图谱；
[0040] 图2是本发明实施例2的食用向日葵杂交种SH363的电泳图谱；
[0041] 图3是本发明实施例3的食用向日葵杂交种SH363的电泳图谱；
[0042] 图4是本发明实施例4的食用向日葵杂交种SH363的电泳图谱。
【具体实施方式】
[0043] 本发明所使用的主要试剂如下：
[0044] RNase A生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为GE101 ;
[0045] GelSafe核酸染料生产厂家为北京原平皓生物技术有限公司，型号为EP106-01 ;
[0046] 所使用的SSR引物生产厂家为生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0047] EasyTap Buffer for PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为 API12-02 ；
[0048] dNTPs生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为API 12-02 ;
[0049] EasyTap DNA Polymerase for PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司、型 号为 AP112-02 ;
[0050] TEMED生产厂家为SIGMA，型号为T8133 ;
[0051] 本发明所使用的主要