一种食品微生物定性与定量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肉类食品微生物定性与定量的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 食品容易受多种有害微生物污染，给人的生命健康造成危害，因此，食品微生物精 确地定性与定量检测是十分必要的。
[0003] 现有食品微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、芯片检测、16S rRNA测序、 宏基因组测序和实时定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）。形态学计 数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不可检测，一次仅能够检测一种 微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果粗糙，无法对种以下的分类单元进行区分。芯 片检测所需的待测样品的DNA量大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准 确，且无法做定量检测。16S rRNA测序无法对种以下的分类单元进行区分。宏基因组测序深 度有限，对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR-次只能检测一种微生 物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的可靠性，使得结论实 用性差。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本发明实施例提供了 一种肉类食品微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：
[0005] 本发明实施例提供了一种肉类食品微生物定性与定量的检测方法，所述方法包 括：
[0006] 确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所 述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为食品；
[0007] 根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物 的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和 所述参考微生物的特征区域；
[0008] 制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微 生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增 引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得 到混合多重扩增引物；
[0009] 向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；
[0010]提取所述混合样品的核酸；
[0011] 利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产 物；
[0012] 利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；
[0013] 根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和 定量分析。
[0014] 具体地，所述目标微生物类群的数目2 1个，且每个所述目标微生物类群包括2 0 种所述目标微生物；
[0015] 所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、 藻类和原生动物中的至少一种；
[0016] 所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、 藻类和原生动物中的至少一种。
[0017] 具体地，所述确定待测样品中的非目标生物的方法包括:将所述非目标生物确定 为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，则 所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物;若不能获得所述目标微生物类 群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它 生物。
[0018] 具体地，所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生物的参 考基因组上的核酸序列;所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组 中为单一序列;所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不 同微生物间保守;所述目标微生物类群的特征区域的区分度2 3;
[0019] 所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源;所述目标微 生物的特征区域的m2值2 2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类 群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；
[0020] 所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列;所述 参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列;所述 参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。
[0021] 进一步地，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微 生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域 是所述混合多重扩增引物以所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不 为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度= 3XLl/4,其中， L1为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。
[0022] 具体地，在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在 提取所述混合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。
[0023] 具体地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：
[0024] 将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异 碱基数< nl时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区 域，其中，nl为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数;若比对成功的所述 目标微生物类群的特征区域2 1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群 的特征测序片段；
[0025] 将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进 行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因 型;在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应 的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标 微生物的标准基因型的差异碱基数<n2,其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最 大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微 生物的特征测序片段；
[0026]将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算 获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；
[0027]若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5 2 α5,则判断所述待测样品 中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障;若所述目标微生物类群的特征测序片段 存在的概率Ρ5〈α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；
[0028]若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率Ρ6 2 α6，则判断所述待测样品中存 在所述目标微生物，其中，α6为概率保障;若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率Ρ6 <α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；
[0029] nl使得Pl^al且Ρ3<α3,其中，Ρ1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片 段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性 的概率;Ρ3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群 的特征测序片段而产生的假阴性的概率;α?和α3为判断阈值；
[0030] η2使得Ρ2 < α2且Ρ4 < α4,其中，Ρ2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的 所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率;Ρ4 为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而 产生的假阴性的概率;α2和α4为判断阈值；
[0031] P5 = 1-BIN0M.DIST(S1,S1,P1,FALSE),P6 = 1-BIN0M.DIST(S3, S3,Ρ2,FALSE), S1 为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量 的中位数;S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数 量的中位数，FALSE为参数值;BINOM. DIST函数返回一元二项式分布的概率。
[0032] 进一步地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定量分析方法如下：
[0033]所述目标微生物类群的量Ml =Mr X S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信区间 为[Mil，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量;S2为所有的所述参 考微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数量的中位数;Mil和M12分别为 Ml值的置信区间的下限与上限；
[0034] 所述目标微生物的量M2 = Ml X S3/S1，所述目标微生物的量的置信区间为[M21， M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限；
[0035] Ml 1 =M1 X (1-S4/S1) ,M12=M1 X (1+S5/S1) ,M21 =M2 X (1-S6/S3) ,M22=M2 X (1+ S7/S3);其中，S4为假阳性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S4 = CRITBIN0M (1^少1，〇9)，其中，1^为计算51的所述目标微生物类群的特征区域的所述多重扩增引物所 扩增的所述非特征区域的所述高通量测序片段的数量;S5为假阴性的所述目标微生物类群 的特征测序片段的数量且S5 = CRIT BIN0M(S1，Ρ3，α9)，其中，α9为概率保障;S6为假阳性的 所述目标微生物的特征测序片段的数量且S6 = CRITBINOM(Sl，P2，al〇)，S7为假阴性的所述 目标微生物的特征测序片段的数量且S7 = CRITBINOM(S3，P4，al〇)，其中，al〇为概率保障； CRITBIN0M函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值。
[0036] 进一步地，卩1 = 81觀1.0151'(111，1111，11，丁1?1^)，？2 = 81觀1.0151'(112，1112，11， TRUE)，P3 = l-BINOM.DIST(nl，Ll，E，TRUE)，P4= 1-BIN0M.DIST(n2，L2，E，TR UE)，其中，ml 为所述区分度;所述m2为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的其它所述微 生物间差异碱基的最小值;L1为所述目标微生物类群的特征区域的长度;L2为所述目标微 生物的标准基因型的长度;E为碱基错误率。
[0037] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明提供的方法不需要对微 生物进行预培养与增殖，耗时短，可同时检测多种微生物，通量高，计数时抽样量大，检测结 果精细，能够对分类单元进行区分，无需大量的DNA并避免了富集培养，检测结构无噪音且 准确，对于低含