一种检测人egfr、kras、braf基因突变的引物组合及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物及其试剂盒，属于分子生 物学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据世界肿瘤研究治疗领域权威机构NCCN推荐，肺癌患者，尤其是非小细胞肺癌 (NSCLC)患者，建议进行EGFR基因突变检测。EGFR激活突变的存在对选择治疗用抗癌药物具 有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突变，尤其是它的19号外显子缺失突变，21号外显子 点突变(L858R)，18号外显子点突变，20号外显子的点突变(T790M)，与络氨酸激酶抑制剂 (TKIs)的疗效有高度的相关性。此外，在部分肺癌病人当中，同时存在着EGFR基因和KRAS基 因的突变，而KRAS基因第2，3，4号外显子上的突变与络氨酸激酶抑制剂(TKI s)的疗效有负 相关作用，当KRAS基因存在这些类型突变时，会对靶向EGFR的靶向抗癌药物产生抵抗。同 时，BRAF基因在肺癌当中也存在不同程度的突变。这些突变中最主要的是第1799位核苷酸 上的突变，导致缬氨酸突变成谷氨酸(V600E)，使患者对抗体类药物(如西妥昔单抗)产生抗 药性。因此，检测EGFR、BRAF、KRAS基因的突变情况对指导临床肿瘤用药具有重要作用。
[0003] 在检测人组织细胞样本中EGFR、KRAS、BRAF基因突变的现有技术中，通常采用探针 技术对上述基因突变进行检测（如厦门艾德生物医药科技有限公司生产的EGFR基因检测试 剂盒）。采用荧光探针技术虽然能够提高检测的特异性，但是使用成本过高，同时无法检测 新型突变。另外采用荧光探针，通过突变组探针荧光起峰的Ct值大小进行判断的方法，其缺 陷在于没有有效参照物，虽然引入了内参，但是内参与突变位点并不是同一位点，甚至不是 同一种基因。而且，其Ct值的判断规则基于经验值，因此在检测时由于样本提取质量等因 素，其检测效果并不理想，在实际应用中，可能会出现检测结果的不一致。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的 引物试剂盒。本发明的试剂盒采用ARMS-PCR技术对上述基因突变进行检测，在ARMS-PCR技 术中采用SYBR荧光方法，能够大幅降低成本;同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入 四步法(81°C收集荧光），采用高性能的DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的 可靠性和准确性。
[0005] 此外，本发明的试剂盒还引入了双内参系统，提供了双重判读规则，提高了检测的 准确性和灵敏度。
[0006] 本发明中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突变的突变位点信息如下：
[0007]
ID NO .33所示。
[0014] 所述ARMS引物中，用于扩增正常位点的引物和共用引物扩增得到对应突变位点的 正常基因位点，作为第二内参。
[0015] 上述试剂盒中，还包括如下试剂:DNA聚合酶、10 X DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I、高纯水、阳性对照品和4种dNTP混合物。
[0016] 优选的，所述DNA聚合酶为Taq HS DNA聚合酶。
[0017] 进一步的，上述试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序的试剂，所述试剂中包 含用于扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或多个外显子区域的扩 增引物对。
[0018] 其中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对如SEQ ID N0.34和SEQ ID NO .35所示；
[0019] 用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO. 37所示；
[0020] 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO. 39所示；
[0021] 用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO. 41所示；
[0022] 用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 42和SEQ ID NO. 43所示；
[0023] 用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 44和SEQ ID NO. 45所示；
[0024] 用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 46和SEQ ID NO. 47所示；
[0025] 用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO. 49所示。
[0026] 所述用于对样品进行桑格测序的试剂中，还包含对EGFR、KRAS和BRAF基因扩增产 物进行测序的测序引物；其序列分别如SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID N0.46和SEQ ID N0.48所示。
[0027] 作为一种具体的应用形式，上述试剂盒的组成包括：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF 基因突变的ARMS引物、Taq HS DNA聚合酶、Taq HS DNA聚合酶10X缓冲液、SYBR-Green-I (1:30000)、高纯水、阳性对照品、4种dNTP混合物和用于对样品进行桑格测序的试剂。
[0028]上述试剂盒在制备检测或辅助检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的产品中的应用 也属于本发明的保护范围。
[0029]本发明进一步提供一种非诊断目的的利用上述试剂盒检测人EGFR、KRAS、BRAF基 因突变的方法，采用上述ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，在81°C采集荧光信 号，根据Ct值对检测结果进行判读，若ACt-l ? ACt_2(差别在1个循环内），ACt_2>8,则检 测结果为阴性；
[0030] 若ACt-l>ACt_2, ACt_2〈8,则检测结果为阳性。
[0031] 进一步的，若Δ ct_2〈4,则为强阳性;如果4〈 Δ ct_2〈8,则为弱阳性。
[0032] 其中，ACt-l:突变组Ct值减去第一内参组Ct值；
[0033] ACt-2:突变组Ct值减去第二内参组Ct值。
[0034] 上述方法，所述PCR扩增的条件为:95°C预变性3分钟；按95°C20秒，68°C25秒，72°C 25秒，扩增反应15个循环;再按95°C20秒，64°C20秒，72°C20秒，81°C20秒，扩增反应30个循 环。
[0035]本发明的有益效果：
[0036] (1)本发明在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照 外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，即与对应的突变位点一致的正常基因位点 作为第二内参，这样能够确保检测的一致性。双内参系统和对应的双重判读规则避免了现 有技术的缺陷，判读基于综合判断，并不依赖经验值，能够给出更可靠的突变比例数据，提 高了检测的准确性，减少了错误率。
[0037] (2)本发明在ARMS实时荧光定量技术中，采用SYBR荧光方法，能够大幅降低检测的 成本，同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入四步法(81度收集荧光），采用高性能的 DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的可靠性和准确性。
[0038] (3)本发明的检测试剂盒中，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对 已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度和准确度。
【附图说明】
[0039] 图1:EGFR Exon-19-ARMS已知阳性样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0040] 图2:KRAS Exon-2-ARMS已知阳性样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0041] 图3:采用未经优化的引物检测KRAS Exon-4的样本实时荧光定量扩增曲线图； [0042]图4:采用经优化后的引物检测KRAS Exon-4的样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0043] 图5:EGFR Exon-18-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0044] 图6:EGFR Exon-19-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0045] 图7:EGFR Exon-20-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0046] 图8:EGFR Exon-21-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0047] 图9:KRAS Exon-2-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0048] 图10:KRAS Exon-3-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0049] 图11:KRAS Exon-4-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0050] 图12:BRAF Exon-15-ARMS样本实时荧光定量扩增曲线图；
[0051] 图13:EGFR E