一种增强型绿色荧光蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一些新的英光蛋白，本发明的英光蛋白是对来自大型多管水母的增强 型绿色英光蛋白多肤巧GFP)的改造，所得新型英光蛋白与EGFP具有相同的激发和发射 光谱，但其英光强度更强、成熟更快，其特征在于由SEQ. ID. NO ;1所示氨基酸序列中Q8化， V164A，I168V位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本发明还涉及上述英 光蛋白基因的克隆、表达及应用。
【背景技术】
[0002] 绿色英光蛋白（green fluorescent protein, GFP)是一类存在于包括水母、水媳 和珊瑚等腔肠动物的生物发光蛋白，当受到特定光谱激发时，GFP发射绿色英光。最初是由 〇1曰166分离自46911〇'6曰￥^扣'1曰（美国专利5,491，084)。胖曰'(1和〇1曰166在口口'公布胖0 95/21191中报道对其氨基酸序列作了修饰W增加其亮度。
[0003] 在化alfie等首先异源表达出野生型GFP基因之后不久，美国Tsien研究小组就通 过随机突变从表达GFP的大肠杆菌中筛选出了几株英光强度更强的和/或英光光谱改变的 GFP变体，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有 所改变的变体，如英光强度增强的GFP巧GFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP。EGFP为增强 型GFP英光蛋白，它是在大型水母GFP的蛋白序列上包含了 4个氨基酸的突变（F6化，S65T， A72S和肥31L)。该突变可W明显提高在最大激发峰下的摩尔消光系数，将亮度提高2. 08 倍（表1)。突变GFP的序列，使其蛋白结构更易于成熟，英光基团也更易于成熟将明显提高 英光蛋白的亮度。
[0004] 表1 ;GFP和EGFP蛋白的亮度参数
[0005]
[0006] GFP的变体可作为细胞内基因表达的报告基因，研究基因表达的调控。GFP英光 蛋白的检测极其方便，一旦正确折叠形成晶体，利用藍光激发就可W检测到它的表达，因此 奸P及其变体作为报告基因具有不需要底物和辅助因子的优越性。可W构建各种缺失了启 动子或增强子序列的奸P载体，利用它们来作为英光作为测定组织特异性启动子和特殊的 增强子。
[0007] 利用已知技术易于将编码目的蛋白的核巧酸序列与奸P DNA突变体在氨基末端或 駿基末端相连，从而制备融合蛋白。GFP及其变体可作为其他蛋白的分子标记，与其他蛋白 融合表达，监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记及疾病诊断等。
[0008] 为了进一步获得新的英光强度增强的GFP变体，本发明人采用新型体外突变技术 "DNA重排值NA shuffling)技术"结合"基因突变技术"对现有的增强型EGFP上进行定点 饱和突变和随机突变，然后通过DM重排建库，筛选得到突变体GFPSpark。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个方面，提供了一种更稳定的增强型英光蛋白，其特征在于SEA 瓜NO ;13所示氨基酸序列，与EGFP相比，包含了 Q8化，V164A，I168V位置上由相应氨基酸 替换的序列所组成。与亲本蛋白相比，所述英光蛋白在37Γ条件下表达蛋白成熟更快，产生 的英光强度更高，在哺乳动物细胞中能获得良好表达。
[0010] 本发明的又一方面，还提供了上述项英光蛋白与目的基因融合在一起表达，用于 检测细胞内基因表达、蛋白定位的标记等用途。该更稳定的增强型英光蛋白比EGFP能激发 出更强的亮度，指导蛋白的表达和细胞定位。
【附图说明】
[0011] 图1 ;HPLC检测EGFP和GFPSpark的纯度，如图所示EGFP (图Α)和GFPSpark (图 B)的SEC-HPLC结果为94. 58 %和96. 51 %，HPLC显示两种蛋白的纯度较好，结构相同，均为 单体结构。
[001引 图2 ;SDS-PAGE检测EGFP和GFPSpark的纯度及大小，如图所示EGFP和GFPSpark 两种蛋白的纯度较好，大小与预测一致。
[0013] 图3 ;GFPSpark蛋白的英光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为英光强度，由图可 看到，本发明GFPSpark蛋白的激发峰为487nm，发射峰为508nm。
[0014] 图4 ;EGFP和GFPSpark的抑稳定性测定，图片显示EGFP的pka为5. 0, GFPSpark 的 pka 为 4. 5。
[001引图5 ;真核细胞内亚细胞器的抑值情况。
[0016] 图6 ;EGFP和GFPSpark的消光系数检测，图片是依据检测进行的曲线拟合计算， EGFP的消光系数为39000, GFPSpark的消光系数为47000。
[0017] 图7 ;EGFP和GFPSpark的量子产率检测，图片显示检测时扫描的波谱图。W EGFP 的量子产率0. 60为参照，计算得到GFPSpark的量子产率为；0. 62。
[001引图8 ;变性后的EGFP和GFPSpark的再折叠检测，EGFP和GFPSpark的英光基团成 熟检测。图A显示EGFP和GFPSpark的再折叠速率分别为；570s和270s ;图B显示EGFP和 GFPSpark的英光基团成熟速率分别为；1560s和1305s。
[0019] 图9;英光蛋白的光漂白特性检测，图片显示了英光蛋白在紫外光作用下英光稳 定性的变化趋势。
[0020] 图10 ;GFPSpark与目的基因融合表达载体示意图，图A为GFPSpark放在目的基因 N端表达的载体示意图，图B为GFPSpark放在目的基因 C端表达的载体示意图。
[0021] 图11 ;在化la细胞系中，线粒体蛋白AK4与GFPSpark融合蛋白（图A)和AK4与 EGFP融合蛋白（图B)表达英光图像。
[0022] 图12 ;在化la细胞系中，细胞骨架蛋白TUBB与GFPSpark融合蛋白表达的英光图 像。
[0023] 图13 ;在化la细胞系中，高尔基体蛋白G0LM1与GFPSpark融合蛋白表达的英光 图像。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1. GFP突变文库的构建：
[00巧]通过Discovery S化dio4. 0蛋白结构分析软件对EGFP(氨基酸序列见沈化ID. NO : 1)结构的分析，找出可能影响GFP结构的32个位点，送32个位点是；D20, K27, S31，T39， Y40, F47, 148, V69, S73, Q81, A88, F100, N106, K108, D118, L126, E143, M154, V164, 1168, 1172, D174, S176, L179, G190, L195, Q205, A207, K215, M219, V225, L232。按照间隔的点 突变，将送32个点错开分成8组。分别对每组每个位点的氨基酸序列做饱和突变，送样得 到了 8组饱和突变的基因库编号为mutl-8 ;同时用易错PCR方法（error prone PCR)对 EGFP基因进行随机突变，得到一组突变基因库，mut-9 ;将送9组突变基因的PCR混合物采 用DNA Shuffling的方法进行随机重组，获得最终的GFP突变片段，插入祀T24载体，建立 EGFP-DS1文库，筛选英光强度高的突变型。
[0026] Mutl-8库的构建方法为：分别在首尾引物中设计BamHLPstl位点，上游引物序列 是 FP-Bam-F ; 5 ' GGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3 ' (SEQ. ID. NO ; 2)，下游引物序列 FP-Pst-R ;5' GGACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG 3' (SEQ. ID. NO ;3)。突变氨基酸正 向饱和引物设计是"NNK"，反向饱和引物设计是"NNM"，送样每组基因需要设计4对突变引 物，W质粒PCDNA3-EGFP为模板（核巧酸序列为SEQ. ID. NO ;4)分段扩增，然后用重叠 PCR 法W首尾引物组合成完整的mutl-mu巧突变PCR产物。
[0027] Mut9库的构建方法为：同样用FP-Bam-F/FP-Pst-R引物W质粒PCDNA3-EGFP为 模板进行易错PCR扩增全长EGFP基因，随机引入突变位点，易错PCR条件为；6mM MgClz和 5mM MnClz 存在下，将 dATP，dGTP，dCTP，dTTP 按不同比例混合巧ml dGTP，2mM dATP, (10， 15,20)mM dCTP 和（10，15,20)mM dTTP]，进行易错 PCR,循环条件为；94°C，5min ;94°C 30s， 55°C 30s，72°C 5〇3,30个循环；72。[，5