拟康宁木霉t-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病害生物防治技术领域，具体地指一种拟康宁木霉Τ-51菌株及其 在番茄促生和灰霉病生物防治的应用。
【背景技术】
[0002] 木霉菌是广泛存在于自然界的一种真菌。木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌 亚口，丝抱纲，丛梗抱目，丛梗抱科。木霉菌广泛存在于±壤、根围、叶围、种子等生态环境 中，也是一种优良的生防菌。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性和多机制性，因此该菌一直 是植物病害生物防治研究的重点对象。
[0003] 番茄灰霉病是由灰葡萄抱(Bot巧tis cinerea化rs.)引起的重要病害，在保护地 生产中危害尤为严重。长期W来，灰霉病防治主要依赖于化学药剂。但由于病菌抗药性迅速 产生，并且化学药剂的过量使用严重污染农产品和生态环境，危及人畜健康。因此，近年来 生物防治正日益成为灰霉病防控中的一条重要的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供了一种拟康宁木霉T-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物 防治的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供的一株拟康宁木霉T-51菌株，其特征在于:菌株为拟 康宁木霉（Trichoderma koningiopsis)T-51，其保藏编号为：CCTCC N0:M 2015729。该菌株 分离自湖北武汉地区油菜田±壤中。T-51菌株通过分子水平上ITS序列的测定，在木霉鉴定 网站化ttp: //www. isth. info/)上鉴定为拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis)。因此 将菌株T-51 定名为拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51。
[0006] 该菌种已于2015年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中屯、(简称CCTCC);保藏登 记号为CCTCC Μ 2015729;保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。
[0007] 进一步地，所述拟康宁木霉Τ-51菌株置于葡萄糖马铃馨琼脂培养基PDA上培养一 周，菌丝发达、产生大量气生菌丝，产生蓬松茂密的产抱簇，呈浅绿色至深绿色，无可溶性色 素，无明显气味，最适生长溫度为24~30°C，光照条件有利于其生长和产抱。
[000引本发明提供了一种拟康宁木霉T-51菌株促进番茄种子萌发和幼苗生长的用途，将 番茄种子在拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液中浸种1~2小时，用于促进番茄种子萌发 及幼苗生长。
[0009] 本发明还提供了一种拟康宁木霉菌株T-51防治番茄灰霉病的应用，使用拟康宁木 霉菌株T-51分生抱子悬浮液抑制灰霉在番茄死体叶片上产抱，W及接种在番茄根际±壤中 防治番茄叶片灰霉病。
[0010] 本发明提供了一种拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液的制备方法，包括W下步 骤：
[0011] 1)将拟康宁木霉Τ-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉Τ-51菌株菌 落；
[001。2)将步骤1)得到的拟康宁木霉Τ-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；
[0013] 3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生抱子，混匀，即得到拟康 宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液。
[0014] 进一步地，所述步骤1)中，培养条件为在溫度为20°C，光照条件下培养2天；
[0015] 所述步骤2)中，培养条件为在溫度为20°C，光照条件下培养2天。
[0016] 其中，PDA培养基的配方：马铃馨200g，葡萄糖20g，琼脂粉llg，补充蒸馈水至 1000ml〇
[0017] PDA制作方法:将洗净后去皮的马铃馨切片，加水800ml煮沸约半小时，用纱布滤去 马铃馨，然后加入葡萄糖20g，将llg琼脂粉加200ml水揽拌均匀，加入上述溶液中，再加水补 足至1000ml，揽拌溶解后分装灭菌。
[0018] 本发明提供了一种利用拟康宁木霉T-51菌株制备抑制番茄灰霉病菌生长速率的 滤液的方法，包括W下步骤：
[0019] 1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌 落；
[0020] 2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得 到培养物；
[0021] 3)将步骤2)得到的培养物离屯、，取离屯、上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细 菌过滤器再次过滤，得到滤液。
[0022] 其中，PDB液体培养基的配方:马铃馨200g，葡萄糖20g，补充蒸馈水至1000ml。
[0023] PDB制作方法:将洗净后去皮的马铃馨切片，加水1000ml煮沸约半小时，用纱布滤 去马铃馨，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，揽拌溶解后分装灭菌。
[0024] 进一步地，所述步骤1)中，培养条件为在溫度为20°C，光照条件下培养2天;所述步 骤2)中，培养条件为在溫度为25°C、150r/min的条件下振荡培养7d。
[0025] 本发明还提供了一种拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对番 茄灰霉病抑制的应用，所述挥发性物质在密闭条件下抑制灰霉菌丝生长、抱子萌发，W及防 治番茄果实灰霉病。
[00%]本发明的有益效果在于：
[0027] 1)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的分生抱子悬浮液对番茄种子萌发和番茄幼苗 生长的促进作用，W及对番茄灰霉病的抑制作用。
[0028] 2)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对灰霉菌丝生长的抑制作用。
[0029] 3)本发明的拟康宁木霉T-51菌株在PDA上生长产生的挥发性物质对灰霉菌丝生 长、分生抱子萌发和灰霉抱子对番茄果实侵染的抑制作用。
【附图说明】
[0030] 图1为拟康宁木霉T-51菌株的菌落形态(PDA，20°C，7d);
[0031 ]图2为拟康宁木霉τ-51菌株的分生抱子悬浮液浸种对番茄种子萌发的促进作用；
[0032]图3为拟康宁木霉Τ-51菌株的分生抱子悬浮液浸种对番茄幼苗生长的促进作用；
[0033] 图4为拟康宁木霉Τ-51菌株的分生抱子悬浮液处理对灰霉在番茄死体叶片上产抱 的抑制作用；
[0034] 图5为拟康宁木霉Τ-51菌株的分生抱子悬浮液接种番茄根际±壤对番茄叶片灰霉 病的防治效果；
[0035] 图6为拟康宁木霉Τ-51菌株的液体培养物滤液对灰霉菌丝生长的抑制作用；
[0036] 图7为拟康宁木霉Τ-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对灰霉菌丝生长的 抑制作用；
[0037] 图8为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对灰霉抱子萌发芽 管生长的抑制作用；
[0038] 图9为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对番茄果实灰霉病 的防治作用。
【具体实施方式】
[0039] 为了更好地解释本发明，W下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于W下实施例。
[0040] 实施例1拟康宁木霉T-51菌株的分离及鉴定
[0041] -、菌株的分离
[0042] 微生物是在湖北武汉地区油菜田±壤中分离的一株拟康宁木霉菌株。其分离方法 为:取0.1 g样品±壤，加 lOOmL无菌水，充分震荡混匀后取壤悬浮液涂布于添加了乳 酸的PDA培养基上，吹干后，置于2(TC培养。待平板上长出真菌菌落后，根据木霉的形态特 征，挑出菌丝生长速度较快，产生绿色产抱簇的菌落。分离的木霉菌株使用平板稀释法进行 单抱纯化:分离的菌株在PDA上生长7天后，用无菌水洗下抱子，在血球计数板上计算抱子浓 度，并用无菌水稀释至3 X 102个抱子/mL的抱子液，取100化抱子液涂于PDA平板上，使每个 平板上的抱子数量大约在30个左右，W便于分离单抱。平板吹干后，在2(TC下培养4她，挑取 单菌落，即为纯化菌株(图1)。
[0043] 二、菌株的鉴定
[0044] 将上述木霉鉴定是基于ITS序列的DNA条形码系统进行鉴定。通过引物ITSU5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '）和口S4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '）对菌株的总DNA进行PCR 扩增，在木霉鉴定网站化ttp://www. isth. info/)的化ichOKey工具进行比对鉴定，鉴定结 果为拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis)，即为拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis)T-51，其保藏编号为：CCTCC N0:M2015729。
[0045] 实施例2:拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液对番茄种子萌发及幼苗生长的促 进作用
[0046] -、拟康宁木霉T-51菌株的分生抱子悬浮液对番茄种子萌发的促进作用
[0047] 供试番茄品种为合作903(番茄大王）。将番茄种子在5 X 106个抱子/mL拟康宁木霉 T-51菌株分生抱子悬浮液中浸种1小时后，均匀摆在铺有双层湿润滤纸的9mm培养皿中，每 皿摆10粒种子，W清水浸种作为对照，每个处理重复Ξ个皿。将摆有种子的培养皿放在28 °C，1化光照条件下，每日按需向培养皿中喷水保湿。7天后，ii量每一粒种子的胚根长度、下 胚轴长度，并统计每个处理的种子萌发率，根据W下公式计算种子活力指数:种子活力指数 =萌发率X (胚根长度+下胚轴长度）。本试验共重复Ξ次(图2)。
[004引二、拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液对番茄幼苗生长的促进作用
[0049] 供试番茄材料:合作903(番茄大王）。试验时间为2014年3月20日至2014年5月26 日。用5 X 106个抱子/mL拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液将番茄种子浸种每个处理72 粒种子，无菌水浸种作为对照。浸种1小时后，将番茄种子播种至装有育苗基质的72孔苗盘， 在网室中生长37天后，每个处理随机选25株番茄幼苗，测量每一株幼苗的真叶叶片数、株 高、茎粗、全株鲜重W及全株干重。最后计算每一株幼苗的壮苗指数:壮苗指数=(茎粗/株 高）X全株干重X 100。试验共重复Ξ次（图3)。试验结果如下：
[0050] 表1.本发明的拟康宁木霉T-51菌株对番茄幼苗的促生效果
[0化1 ]
[0052] 注:数据后注**说明与对照相比有差异显著性(P<0.01)
[0053] 实施例3:拟康宁木霉T-51菌株分生抱子悬浮液对灰霉在番茄死体叶片上产抱的 抑制作用
[0054] 供试番茄材料:合作903(番茄大王）。从生长到2-3个月的番茄植株上选取长势一 致的叶片，用打孔器打成直径为1cm的叶圆片。将叶圆片压在铺有吸水纸的植物标本夹中， 在6(TC下烘干72h。烘干好的叶圆片先在无菌水