一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调节、促进造血恢复、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。
[0003]MSC最初在骨髓中被发现，目前我们已经可以从脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及胎盘、羊水、脐带中分离间充质干细胞。从脐带中分离间充质干细胞具有采集方便、易于保存和运输、对供体无伤害、易分离、纯度高、异体移植不会触发免疫反应等优点。
[0004]目前从脐带中分离间充质干细胞的方法有组织块贴壁法和酶消化法。酶消化法主要是采用胶原酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶中的一种或者几种对剪碎的组织块进行消化，其有一个致命缺点是损伤细胞，影响细胞的表征和功能。组织块法虽然培养时间较长，但是其在细胞数量、细胞形态、免疫表型和分化潜能等方面均优于酶消化法。
[0005]目前现行的最接近的技术方案:用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污;将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通胶，同时去除脐动脉和脐静脉;将剥离的华通胶均匀剪碎;用MSCs培养基重悬剪碎的华通胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，待细胞生长融合至80%_90%时进行消化传代。
[0006]目前技术缺陷:现有技术是采用普通的培养基来进行脐带间充质干细胞的分离和培养，培养周期较长;并且没有提及相关检测手段，无法保证获得安全有效的细胞产品。
[0007]本发明既可以有效降低成本又可以快速获得优质的间充质干细胞，减少对细胞的伤害，缩短了培养周期，减少污染，而且能够提高细胞纯度。
【发明内容】
[0008]本发明提供一种从人脐带华通胶(Wharton’sJelly)中分离脐带间充质干细胞并进行传代培养，最终获得细胞产品的方法，要解决脐带间充质干细胞分离、培养过程中可能出现的分离效率低、周期长、安全性不足等问题。
[0009 ]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
在脐带获得、脐带运输、脐带制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脐带间充质干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。
[0010]所述方法包括如下:
I)在无菌环境中，将脐带消毒后放在添加了储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备；其中储运液为40ml的α-ΜΕΜ，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B5ug/ml;运输温度为4-25°C，运输时间不超过24小时；
2)脐带瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中；
3)在细胞培养皿中，使用洗涤液充分洗涤脐带3-6次，将脐带两端各剪去Icm长度，丢弃;再洗涤脐带组织2-4次;其中洗涤液为添加了 100U/ml庆大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml两性霉素B的医用生理盐水；
4)将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，转移脐带组织至新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处;去除静脉血管和动脉血管，撕取华通胶;华通胶置于加1ml洗涤液的50ml离心管中；
5)华通胶用洗涤液充分洗涤3次，再用生理盐水洗涤2次，转移至新的50ml离心管中，充分剪碎至Imm3?3mm3大小；
6)用去前段的1ml移液管将华通胶块平分到4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底;其中，完全培养基为α-ΜΕΜ中添加10% FBS及如下细胞因子组合:EGF 5?10ng/ml + PDGF 5?10ng/ml + TNF_a3?10 ng/ml + IFN-γ 3-10 ng/ml ；
7)小心将培养瓶放入37°C、5%C02培养箱中；培养最初7天，保持培养瓶绝对静止；
8)第8天根据生长情况，用75%酒精消毒培养基瓶外壁，放置到生物安全柜内；
9)用去头移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入1ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
10)每瓶加消化液3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37°C孵育Imin或室温孵育3min;待细胞变圆后每瓶加终止液10ml，快速震荡，用1ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加1ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中；
11)1200rpm，离心6min，弃上清;合并沉淀至I管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用1ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数；
12 )根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为3?5 X 104/ml，标记，置37 °C、5%C02培养箱中培养；
13)观察细胞，细胞生长至接近愈合时进行收获冻存。
[0011 ]所述冻存的具体步骤为:
1)配置终止液，消化前3min将消化液放置到37°C水浴锅中，把冻存母液平衡到4°C;
2)将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内；
3)用移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入1ml生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；
4)每瓶加入3ml消化液，37°C消化Imin，当细胞明显回缩后，加入终止液1ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加1ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中；
5)1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混勾取Iml做计数和流式检测；
6)加生理盐水至40ml，取500μ1上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min；
7)将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管Iml;冻存细胞数为5-10 X 106/ml，如果细胞太少应增加传代；
8)标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外；
9)将冻存管置于预先4°C处理的程序降温盒中，放置-80°C对开门冰箱中24h，再将样本转入液氮罐中，记录储存位置。
[0012]优选的所述的细胞因子组合:EGF6ng/ml + PDGF7ng/ml + TNF_a5ng/ml + IFN-γ 5ng/ml。
[0013]所述的消化液含0.25wt.% 胰酶、0.03wt.%EDTA。
[0014]本发明的优点在于:
在脐带获得、脐带运输、脐带制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脐带间充质干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。
[0015]在培养基中加入EGF、PDGF、TNF_a和IFN-γ同时加入培养体系中可以有效促进MSC的增殖，从而有效缩短培养时间，并能维持其表型特征。
[0016]静止培养7天，有助于促进组织块的贴壁和细胞的爬出。储运液和洗涤液中添加了庆大霉素，青霉素，两性霉素B能够有效预防和控制细菌、真菌污染。细胞收获时进行计数、流式检测、内毒素检测、支原体检测、细菌培养检测等，只有各项检测均合格才准予入库储存，从细胞数量、细胞表征和有无微生物污染等多方面保证了细胞产品的有效性和安全性。
【附图说明】
[0017]图1.实施例1脐带间充质干细胞在分离、培养过程中的状态(40倍显微镜下观察)。a)组织块铺瓶7天之后的细胞状态;b)组织块铺瓶12天之后的细胞状态;c) PO传Pl第2天的细胞状态;d) PO传Pl第4天的细胞状态;e) PO传Pl第6天的细胞状态。
[0018]图2.实施例1脐带间充质干细胞流式检测结果图。
[0019]图3.实施例2脐带间充质干细胞在PO传Pl第4天的细胞状态。
[0020]图4.实施例3脐带间充质干细胞在PO传Pl第4天的细胞状态。
[0021]图5.市售培养基培养的脐带间充质干细胞在PO传Pl第4天的细胞状态。
[0022]图6.不同培养基配方的培养时间统计。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
I脐带制备:
I)在无菌环境中，第三产程时采集脐带，注意放尽脐带动静脉残血并结扎;采集后的脐带消毒后放在添加了储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备。其中储运液为40ml的α-ΜΕΜ，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml。采集前确保孕妇病毒五项检测均为阴性、ALT检测合格。运输温度为4°C，运输时间不超过24小时。
[0024]2)脐带瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中。
[0025]3)在150cm2细胞培养皿中，使用洗涤液充分洗涤脐带3次，用尖头直剪将脐带两端各剪去I cm长度，丢弃。再洗涤脐带组织2次。其中洗涤液为添加了 100U/ml庆大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml两性霉素B的医用生理盐水。
[0026]4)用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，清洗3次。转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处。去除静脉血管