基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及SSR引物组领域，具体设及一种基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序 列开发的EST-SSR引物组及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛鞭草是禾本科(Gramineae)牛鞭草属巧emarthria R.化.）植物的总称，風I名牛 仔草、铁马鞭，广泛分布于我国长江W南各省（区）及河北、山东、陕西等地。东南亚、印尼、印 度及美国、己西等暖溫带和热带地区也有分布。它的种类较多，全世界有近20种，其中扁穗 牛鞭草(；Hema;rth;ria compressa)和其近缘种高牛鞭草巧ema;rth;ria曰11:133；[1]1日)是牛鞭草 属中尤为重要的2个多年生优良暖季型饲草物种，主要分别分布于我国与非洲地区。因具有 生长速度快，高产优质，营养丰富，适口性好，耐贫瘡±壤，高抗及较强的竞争性等优点，该 两个牛鞭草物种已在热带、亚热带地区得到广泛的研究与利用。牛鞭草即可放牧利用，又可 调制干草、青胆，W及保持水±、绿化环境，因此其在畜牧业发展、生态环境建设和草地农业 系统中占有着重要的地位。
[0003] 尽管牛鞭草具有重要的生态和经济效益，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，尤 其分子水平研究较少，主要集中于扁穗牛鞭草和高牛鞭草野生种质资源遗传多样性的研究 与DNA指纹图谱的构建。虽较多分子标记如4。1^\1851?、51?4?、551?、651'-55巧日5(：〇1'等运用于 牛鞭草研究中，但它们大多采用运用于其他物种上的通用引物，而有关牛鞭草特异引物却 尚无报道。牛鞭草由于种子结实率低，缺乏有效的有性繁育系统，多表现为W茎节杆插为主 的无性繁殖，因而常规的育种技术无法加 W利用，导致牛鞭草的育种进程停滞不前，现有的 品种均为野生驯化而来，分子辅助育种将成为牛鞭草育种的重要手段。但目前牛鞭草的研 究成果对于牛鞭草分子育种是远远不足的。因此，丰富牛鞭草基因组资源已成为当务之急。
[0004] 简单重复序列（SSR，Simple Sequence Repeat)又称为微卫星DNA，是分子标记辅 助育种首选标记之一。其W2-6个核巧酸为基本单位的串联重复序列组成的DNA片段，长度 大多为100-200个碱基对，具有分布广泛，多态性丰富，重复性好，共显性遗传，物种间转移 性好等特点，已被广泛应用于品种鉴定，种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记 辅助选育等研究领域。SSR虽是W测序技术为基础的分子标记，但随着目前二代测序的越来 越普遍W及Ξ代测序的新起，其开发费用的逐渐降低，加速了它在物种上的开发利用。其中 EST-SSR是基于EST序列或cDNA数据开发的一种SSR分子标记。而转录组数据正是开发EST- SS財示记的理想资源，并基于转录组的EST-SS財示记除具有一般分子标记的特点外，还有其 特殊优势。第一，信息量大。如果发现一个基因标记与某一性状连锁，那么该转录本就可能 与控制此性状的基因相关。第二，通用性好。由于转录本保守性较高，故具有较好的通用性， 在亲缘物种之间校正连锁图谱和比较作图方面有很高的利用价值。迄今，未见转录组测序 技术运用于牛鞭草植物中，也没有牛鞭草某物种关于EST-SSR分子标记开发应用的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列 开发的EST-SSR引物组。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:该基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录 组序列开发的EST-SSR引物组，所述引物组包括52对引物，其核巧酸序列如序列表SEQ肥NCE ID NO. 1 ~104所示。
[0007] 本发明还提供了上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物 组在牛鞭草分子遗传多样性分析中W及在牛鞭草种质遗传系谱分析中的应用。
[0008] 本发明还提供了上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物 组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的应用。
[0009] 本发明还提供了一种上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR 引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，包括如下步骤：
[0010] A、提取待测牛鞭草样品基因组DNA;
[00川 B、w步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表沈卵ENCE ID NO. 1~104所示 引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0012] C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
[0013] D、利用步骤C的统计结果进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析。
[0014] 进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15化，其中包括1.扣 L浓度为20ng/yL的模板DNA，7.5化的2X Reaction Mix,0.3化的Golden DNA Polymerase, 0.6山农度为lOpmol/yL的正向引物，0.6山农度为lOpmol/yL的反向引物，余量为d地2〇。
[001引进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94 °C预变性5mi η;然后94 °C变性 30s，52-56°C退火45s，72°C延伸Imin，共35个循环；最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[0016] 进一步的是，所述牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的统计方法 为:利用NTSYS-PC 2.10软件计算遗传相似系数，并进一步基于UPGM法进行聚类分析，采用 P0PGEN vl. 32软件计算化annon信息多样性指数（I)、化i ' S遗传多样性指数化e)和遗传相 似系数。
[0017] 本发明还提供了一种上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR 引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
[001引 a、提取待测禾本科物种样品基因组DNA;
[0019] b、W步骤a提取的待测样品DNA为模板，利用序列表沈卵ENCE ID N0.1~104所示 引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0020] C、将步骤b得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
[0021] d、利用步骤C的统计结果在禾本科其它牧草物种上进行转移性分析。
[0022] 进一步的是，在步骤b中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15化，其中包括1.扣 L浓度为20ng/yL的模板DNA，7.5化的2X Reaction Mix,0.3化的Golden DNA Polymerase, 0.6山农度为lOpmol/yL的正向引物，0.6山农度为lOpmol/yL的反向引物，余量为d地2〇。
[0023] 进一步的是，：在步骤b中，所述PCR扩增程序为：94°C预变性5min;然后94°C变性 30s，52-56°C退火45s，72°C延伸Imin，共35个循环；最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[0024]本发明的有益效果在于:本发明所述的52对EST-SSR引物组来自扁穗牛鞭草与高 牛鞭草幼叶与根系转录组序列，比W往的禾本科共用EST-SSR引物相比具有多态性丰富、扩 增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时运些引物成功运用到牛鞭草遗传多样性分析与转 移到禾本科其他物种上，丰富了牛鞭草可用SSR引物的数量，并可有效用于牛鞭草种质资源 遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建、分子标记辅助育种等研究W及运用在其他禾本 科物种的相关研究上。
【附图说明】
[002引图1是本发明实施例所述44份牛鞭草材料的UPGMA聚类图；
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0027] 对扁穗牛鞭草和高牛鞭草幼叶与根系进行转录组测序，得到的大于1化拼接好的 Unigene进行合并后利用软件MISA化ttp ://pg;rc . ipk-gatersleben. de/misa/)进行EST- SSR位点的扫描。筛选标准为2个碱基至少重复六次，3,4,5,6个碱基至少重复五次才被识别 为SSR位点。最后获得了 10,888个EST-SSR位点，随后利用Primer 3v 2.23(http:// primers, sourceforge.net)对运些候选位点进行了引物设计，设计参数设定为：引物长度 范围在18-2化t间，最适长度为21nt;PCR产物的长度在10化P和3(K)bp范围内；引物退火溫度 为52-58°C，其中55°C为最优溫度;GC含量范围在40%到60%间，最适GC含量为50%。最后成 功设计了 4，846对EST-SSR引物。其中，本发明对其中52对EST-SSR引物组进行了验证和转移 性研究，52对EST-SSR引物序列如下表1所示，其核巧酸序列如序列表SEQ肥NCE ID NO. 1~ 104所示。
[0028] 表1基于扁穗牛鞭草和高牛鞭草转录组序列开发的52对EST-SSR引物信息
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组能够在牛鞭草 遗传多样性分析中W及在牛鞭草种质遗传系谱分析中的应用，其分析方法，包括如下步骤：
[0034] A、提取待测牛鞭草样品基因组DNA;
[0035] 首先，筛选出44份牛鞭草材料来验证开发的SS財示记性能，其供试牛鞭草材料的详 细情况见表2,其中包括34份高牛鞭草化.altissima)材料，8份扁穗牛鞭草化.compressa) 材料，W及Η.uncina化和Η. japonica材料各一份。因牛鞭草为严格营养体繁殖材料，各材料 内单株间遗传背景一致，故1份材料只选取1个单株提取DNA。
[0036] 表2验证开发的EST-SSR引物性能所用的牛鞭草供试材料
[0037]
[003引
[0039]接着，进行基因组DM的提取，选取上述44份牛鞭草材料的健康幼嫩叶片，采用植 物基因组DM提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1%的琼脂糖凝胶电泳检测供 试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于-20°C冰箱中保存备用。
[0040] B、w步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SE卵ENCE ID N0.1~104所示 引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物;所述PCR扩增反应优化体系总体积为1扣L，其中包括 1.5化浓度为20叫/化的模板DNA，7.5化的2X Reaction Mix, 0.3化的Golden DNA Po 1 ymerase，0.6化浓度为1 Opmo 1 /化的正向引物，0.6化浓度为1化mo 1 /化的反向引物，余量 为d地2〇。所述PCR扩增程序为：94°C预变性5min;然后94°C变性3〇3,52-56°(：退火453,721： 延伸Imin，共35个循环;最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[0041] C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果;具体的，先将步 骤B得到的PCR扩增产物用6%变性聚丙締酷胺凝胶（丙締酷胺：甲叉丙締酷胺= 19:1， 7.5mol/L尿素，1 X T邸缓冲液)进行检测，样品点样扣L，W博瑞克公司的D50Marker为对照， 350V电压下电泳140min，银染法显影，照相保存。
[0042] D、对SS財示记扩增产物的电泳图谱进行人工比对、校正，统计强带或清晰弱带，按 照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为"Γ，无条带出现记为"0"， 建立原始距阵。根据原始距阵，统计EST-SS財示记扩增产物的条