一种磷脂酰乙醇胺n-甲基转移酶酶活力检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言，本发 明提供了一种测定憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT，F^hosphatidylethanolamineN- methyltransferase，EC 2.1.1. 1了）酶活力的方法。
【背景技术】
[0002] 胆碱是一种强有机碱，是卵憐脂的组成成分，也存在于神经銷憐脂之中，是生命体 所需要的一种营养物质，胆碱对肝脏和脑的结构和功能、脂肪代谢及胎儿发育具有重要作 用。胆碱对脂肪有亲和力，可使脂肪W憐脂形式由肝脏通过血液输送出去，从而防止脂肪肝 的形成，有效保护和治疗酒精引起的肝纤维化，具有抗肝脂肪过氧化的作用，从而减少酒精 弓植的肝细胞调亡，调节肝细胞活性，降低肿瘤坏死因子的细胞毒性和增强白介素22保护 肝细胞的作用，同时胆碱还具有保护肌肉组织避免损伤的作用。胆碱对胎儿的发育至关重 要，它影响干细胞的增值和调亡而改变脑的结构和功能，同样胆碱缺乏会增加患神经管缺 陷的风险。
[0003] 人类体内胆碱可W部分来自于憐脂酷胆碱，憐脂酷胆碱是所有真核细胞的细胞膜 的基本组成成分。憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)是催化憐脂代谢途径中憐脂酷乙醇胺 N-甲基化反应的一种催化酶，在哺乳动物中该酶能够将S-腺巧酷甲硫氨酸的甲基基团 转移给憐脂酷乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)的N端，通过两个憐脂酷乙醇胺的 中间态物质憐脂酷N-单甲基乙醇胺(PME)和憐脂酷N，N-二甲基乙醇胺(PDE)，最终合成憐脂 酷胆碱(phosphatidylcholine,PC)。
[0004] PMET在肝外组织的活性极低，主要在正常的肝组织中表达，哺乳动物体内肝脏是 唯一的具有显著PEMT酶活力的器官。PEMT具有两种类型，分别是阳MT1和PEMT2,其中阳MT1 位于内质网的胞质一侧的表面，具有非常高的总PEMT活力，是肝脏中主要合成憐脂酷胆碱 的酶。PEMT2分布于线粒体相关的膜部分，据研究发现，PEMT2负责肝细胞20%-40%憐脂酷 胆碱的合成，已有的研究证明其基因表达与肝细胞的增值分裂呈负相关，增值快的细胞如 肝癌细胞、再生肝组织中PEMT2的表达量很低，正常肝细胞中PEMT的表达和活性都较高，研 究表明，PEMT基因敲除的小鼠患有脂肪肝，并且更易患化学诱导的肝癌。还有研究发现 PEMT2的过表达可W抑制重组质粒转染大鼠肝癌CBRH-7919细胞的增值并诱导细胞的调亡。
[0005] PEMT基因具有很高的多态性，目前已经鉴定出一百余个SNP，其中5465G一 A和744G 是已知的具有功能的SNP，能够影响蛋白的活性剂胆碱的需求及肌体的健康。非酒精性 脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是常见的慢性病之一，人群的发病率 高达25%，NA化D可能会发展为肝细胞坏死、纤维化甚至肝硬化。PEMT基因中5465G一A的结 果是导致175位氨基酸由置换，从而引起部分编码PEMT活性缺失，运种基因多态性在NA化D 患者发生率相当于正常人的1.7倍，可W推断PEMT活性缺失与非酒精性脂肪肝的发病有直 接的关系，因此推测人类非酒精性脂肪肝与PEMT基因多态性有关。744G^C位于该基因的启 动子区，约有50个碱基位于雌激素反应元件区域内，744G^C可影响该基因的表达，通过雌 激素介导的ΡΕΜΤ基因的感应从而增加女性对胆碱缺乏的敏感性，有研究显示744CC与GG相 比增加了患乳腺癌的风险。
[0006]有研究显示帕金森病患者脑部额皮质的PEMT活力低于正常人，外源性增加 PME和 PDE后会显著增加脑部的甲基化水平，但在额皮质却没有得到任何修正，说明帕金森病与 阳MT的功能有关，有文献报道阳MT V175M与中国人群的散发型阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)相关。
[0007]还有研究显示，在小鼠体内缺少PEMT表达会导致高密度脂蛋白化igh density lipoproteins,HDL)量的降低W及极低密度脂蛋白（very low density lipoproteins, VLDL)和低密度脂蛋白（low density lipoproteins,LDL)量的升高，化DLW及LDL含量的升 高是动脉粥样硬化发生的危险因素。由此可见PEMT表达和活性的降低有可能是人类动脉粥 样硬化的诱导因素之一。
[0008] 目前PEMT酶活力的检测方法是放射化学法，即通过检测WS-腺巧-L-(甲基-3H)- 蛋氨酸为底物生成憐脂(phosphol ipids)所结合的[甲基-3H]的量，来测定阳MT的活性，运 种放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，不利于推广使用。
【发明内容】
[0009] 因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶 (PEMTJhos地atidylethanolamine N-methyltransferase，EC 2.1.1.17)的酶活力检测方 法不易推广的问题，本发明的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的PEMT酶活力检测方 法。采用该方法可W在半自动或全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性 高，操作简便，因而可W得到切实的推广使用。
[0010] 针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0011] 本发明提供一种憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶(阳MT)酶活力检测方法，所述方法包 括：
[001引（1)将含PEMT的样本与S-腺巧-心甲硫氨酸（SAM)和甲基受体接触W形成S-腺巧- k同型半脫氨酸(SAH)和甲基受体的甲基化产物，
[001引（2)通过将所述SAH与S-腺巧-k同型半脫氨酸水解酶(SA化se)相接触W生成高半 脫氨酸化cy)和腺巧(Ado),采用光度计评估所述Ado的产生速率W检测所述样本中PEMT的 酶活力。
[0014] 优选地，根据前述的阳MT酶活力检测方法，其中，所述甲基受体为憐脂酷乙醇胺类 化合物。优选地，所述憐脂酷乙醇胺类化合物为憐脂酷乙醇胺(PE)或憐脂酷N-单甲基乙醇 胺(PME)。最优选为憐脂酷乙醇胺。
[0015] 更优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：
[0016] (1)将所述含PEMT的样本、所述SAM和所述甲基受体混合并反应获得反应液1;
[0017 ] (2)向步骤(1)中的所述反应液1中加入所述SAHase并反应，获得反应液2;
[0018] (3)将步骤(2)中所述的反应液2离屯、获得上清液；
[0019] (4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或直接地评估所述 Ado的产生速率W检测所述样本中所述憐脂酷PEMT的酶活力。
[0020] 再优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括:在步骤(1)过程 和步骤(2)过程中加入缓冲液。优选地，所述缓冲液选自甘氨酸/氨氧化钢、巧樣酸/巧樣酸 钢、憐酸氨盐/削i酸(盐）、憐酸盐、2-吗嘟代乙横酸缓冲液、3-吗嘟丙横酸缓冲液、4-径乙 基赃嗦乙横酸缓冲液、Tris-盐酸、棚酸-棚砂、己比妥钢-盐酸缓冲液中的一种或多种。最优 选为Tris-盐酸。
[0021] 还优选地，根据前述的阳MT酶活力检测方法，其中，所述缓冲液为10~lOOOmmol/ L，优选为25~lOOmmol/L，最优选为30mmol/L。所述甲基受体为0.002~lOmmol/L，优选为 0.05~0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L。所述S-腺巧-k甲硫氨酸为0.02~2mmol/L，优选为 0.05~0.5mmol/L，最优选为0 . Immol/L。及所述S-腺巧-心同型半脫氨酸水解酶为0.01~ 100KU/L，优选为0.1 ~50KU/L，最优选为 10KU/L。
[0022] 或还优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，步骤（1)中所述反应的条件 为置于35°C环境中溫浴60min。优选地，步骤(2)中所述反应的条件为置于30°C环境中溫浴 1 Omin。更优选地，步骤(3)中所述离屯、为10, OOOg离屯、10分钟。
[0023] 或还优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括在步骤（1) 前将所述含PEMT的样本进行前期处理，所述前期处理为所述含PEMT的样本与试剂混合，所 述试剂为油酸、胆酸盐、Tween 20、化ij35或牛横胆酸钢。优选地，所述试剂在上述混合后， 达到的体积百分浓度为0.05-1 %。最优选为0.5%。
[0024] 进一步优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括，在所述 前期处理后，将所述含PEMT的样本在冰上放置30min。
[0025] 优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述SAM由Ξ憐酸腺巧，甲硫氨酸 和S-腺巧甲硫氨酸合成酶化C 2.5.1.6)组成的酶反应系统所生成。
[0026] 优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述样本选自生物组织、体液和 细胞中的一种或多种。优选地，所述生物组织选自肺、结肠、卵巢、胎盘、膜腺、胸腺、小肠、 肾、脑和肝脏中的一种或多种，所述体液为血液。
[0027] 0
[002引具体地，本发明提供一种阳MT酶活力检测方法，其基本实施过程如下：
[0029] PEMT能够利用S-腺巧-k甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将SAM的甲基转移到甲基 受体上，生成甲基受体的甲基化产物，同时SAM转化为S-腺巧同型半脫氨酸(SAH)，SAH在 S-腺巧-k同型半脫氨酸水解酶(SAHase，EC 3.3.1.1)的作用下产生腺巧(Ado)，产生的Ado 的速率与SAM的减少速率成正比，评估所述Ado的产生速率可W检测PEMT的酶活力。所述甲 基受体为憐脂酷乙醇胺类化合物，如憐脂酷乙醇胺(PE)、憐脂酷N-甲基乙醇胺(PME)，