亚利桑那菌lamp法检测用的引物和检测方法
【专利说明】亚利桑那菌LAMP法检测用的弓I物和检测方法
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技术领域
[0002]本发明涉及分子生物学中用LAMP法对亚利桑那菌DNA的检测。
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技术背景
[0004]目前食品中对亚利桑那菌的检测工作仍然沿用传统的两种细菌学鉴定方法。
[0005]第一种分离纯化鉴定方法的缺点:按最新的亚利桑那菌检测上述国家标准GB4789.4-2010中采用的传统的分离纯化鉴定方法，阳性样品检测周期至少需6天以上;且步骤繁琐，需经过5个步骤才能检测出样品是否含有目标菌;使用平板琼脂分离纯化细菌时，需要依靠经验选取可疑菌落，人为因素影响检测结果，还极易造成漏检。
[0006]第二种抗原抗体反应方法的缺点:目前沙门氏菌分型仍然采用传统的抗原和生化标准，将沙门氏菌分为四个亚属，亚利桑那菌是沙门氏菌的第m亚属，近3000种血清型，血清数量太大，如要在基层检测实验室配备大量价格昂贵的鉴定血清难以实现，因此在实际检测工作中基本失去价值。传统的亚利桑那菌检测方法早已不能满足现代食品安全检测工作的需要，必须开发快速、简便、高通量、高特异性、高灵敏度的检测方法，来丰富和完善食品中致病菌的检测。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种用扩增DNA的LAMP法，检测亚利桑那菌的引物，并且还提供用这种引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测的方法，既提供一种比传统细菌学鉴定亚利桑那菌更具有费用低、灵敏度高、操作简便的LAMP法检测亚利桑那菌的方法。
[0009]
本发明所说的亚利桑那菌是:亚利桑那菌Salmonella arizonae。
[0010]用本发明的引物的作用是，使用分子生物学LAMP检测方法，在样品中检测出亚利桑那菌DNA。
[0011]用本发明设计的LAMP引物与引物是同一个概念。
[0012]本发明的LAMP技术也是LAMP法的含义，也就是环介导等温扩增法(10p-mediatedisothermaI amplificat1n，)简称LAMP技术或LAMP法或LAMP检测法。
[0013]本发明的引物设计和应用概述:首先对以往文献进行梳理，分析了沙门氏菌属，包括亚利桑那菌spvA基因、16SrRNA、0RF的部分基因序列，最终确定spvA基因作为模版检测基因。最终确定spvA基因作为_吴版检测基因的参考文献是:
第一参考文章名称为:Toward a populat1n genetic analysis of Salmonella:Genetic diversity and relat1nships among strains of serotypes S.choleraesuis, S.derby , S.dublin , S.enteritidis, S.heidelberg, S.infantis, S.newport, and S.typhimuriu
第一参考文章作者为:PILAR BELTRAN*t, JAMES M.MUSSER*，REINER HELMUTHt,JOHN J.FARMER iii§, WAYNE M.FRERICHSH, 1.KAYE WACHSMUTH§, KATHLEEN FERRISH, ALMA C.MCWHORTER§, JOY G.WELLS§, ALEJANDRO CRAV1TOt, AND ROBERT K.SELANDER*
第一参考文章期刊名和时间为:Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA Vol.85， pp.7753-7757， October 1988 Medical Sciences
第二参考文章名称为:Salmonella Virulence Plasmid: Modular Acquisit1n ofthe spv Virulence Reg1n by an F-Plasmid in Salmonella enterica Subspecies Iand Insert1n Into the Chromosome of Subspecies II， Ilia, IV and VII Isolates第二参考文章作者为:E.Fidelma Boyd and Daniel L.Hartl
第二参考文章期刊名和时间为:Copyright O 1998 by the Genetics Society ofAmerica0
在GENBANK数据库中，对亚利桑那菌spvA这段基因序列进行检索比对，发现亚利桑那菌与同属中的其它沙门氏菌仅有39个碱基序列差异，为亚利桑那菌保守且特异的DNA序列，因此确定这39个碱基序列
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAAT
能够作为LAMP法检测亚利桑那菌的被检特异DNA序列。然后用这个选定的被检特异DNA序列为基础，进行设计用于LAMP法检测亚利桑那菌的检测用的引物，然后并合成这种检测用的引物，再把这种检测用的引物用LAMP法检测亚利桑那菌。
[0014]本发明的引物设计原理如下:
(I)选取SpvA基因作为靶基因序列:因spvA基因在沙门氏菌属中高度保守，可作为检测沙门氏菌属靶基因序列。
[0015](2)获取靶基因序列:按当前生物基因组数据的获取通用方法，即通过美国国立生物技术信息中心(NCBI，Nat1nal Center for B1technology Informat1n，)管理的GENEBANK数据库进行查询，所获序列都是对全世界公开的，研究人员都可以无偿获取使用的亚利桑那菌spvA基因作为靶基因序列。所以，本发明选用GENEBANK数据库中的亚利桑那菌spvA基因DNA作为本发明的靶基因序列。
[0016](3)选靶基因中的特异性DNA片段:我们选取GENEBANK数据库中的亚利桑那菌spvA基因DNA序列中保守性最高的、LAMP法检测效果最好的一段DNA作为引物的基础DNA来设计LAMP法检测用的检测用的引物，在GENBANK中对这段基因序列进行检索比对，发现亚利桑那菌与同属中的其它沙门氏菌仅有39个碱基片段差异，为亚利桑那菌保守且特异性DNA片段，既39个碱基片段如下:
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAATo
[0017](4)设计LAMP引物:用上述(3)中的39个碱基片段为依据，用现有引物设计技术，设计出本发明的LAMP法检测用的引物，即本发明的4个单独引物组成的引物组序列如下:
弓 I 物F3: AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3: TACGGCAGCAGGGTCG ；引物 FIP: CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG ；
引物 BIP: GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
[0018]
设计本发明的4个单独引物既引物组的规则:
按LAMP反应原理，每次LAMP反应需4个单独引物同时反应，这4个单独引物作为一个引物组，即每组LAMP弓丨物为4个单独引物，本发明的引物组中4个单独引物代号是:B3，F3，BIP，FIP0
[0019]设计引物时，B3，F3，BIP，FIP引物5’和3’最开始的一个碱基保证在5个物种中都是保守的；引物中5’dG和3’dG尽量小于-4.00。
[0020]用本发明的LAMP引物，进行LAMP法检测样品中亚利桑那菌、其它干扰菌和灭菌去离子水对照的检测方法如下:
步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种0嫩:225!111缓冲蛋白胨水(8?￥，81^€6^(1 PeptoneWater)中添加亚利桑那菌标准菌种CMCC47001，培养18_24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB 4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得含有亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL,107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL四种梯度稀释液，然后将这四种梯度稀释液分别取lml，采用水煮模板法或CTAB/NaCl法或QIAGEN公司试剂盒方法中的某一种方法，分别提取这四种梯度稀释液中的亚利桑那菌标准菌DNA;
得到，
第一种试验菌液:含亚利桑那菌浓度