一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊 断试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌目前是全球范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率及死 亡率增长迅速。要降低乳腺癌病人的死亡率除了在病因预防上降低发病率外，提高早期诊 断水平和药物治疗的疗效是两个重要方面。然而，肺癌的早期诊断一直是一个世界性难题， 目前影像诊断(B超、钢祀），化学诊断（癌反应，血清学和免疫学指标)及组织细胞学诊断是 肿瘤诊断的Ξ大支柱，前者在亚临床期诊断上有很大局限性，后二者均W肿瘤标志物作为 观察指标，可W比影像诊断更早发现肿瘤的存在，具有高效、高灵敏性、方便、标本易获取及 创伤小等优点，因此，在乳腺癌早期诊治研究中，筛选及鉴定高特异性的乳腺癌肿瘤标志物 一直是研究的重点和难点。
[0003] 所谓肿瘤标志物，是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者 是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质，反映着肿瘤的存在和生长。我们可通过利用化 学、免疫、分子生物学等技术对血液或分泌物进行定性或者定量的检测，通过对其分析，帮 助我们从正常组织中区别肿瘤或者测定肿瘤细胞核、细胞质W及对细胞膜上的特性进行分 析，W此作为辨别肿瘤细胞的标志。乳腺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最 初阶段设及到许多乳腺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达 多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样。
[0004] 由于乳腺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的 复杂性及多态性，造成单一标志物检测对乳腺癌的诊断价值有限，只能反映了疾病某些侧 面的变化，国内外众多学者倾向于筛选多种有价值的肿瘤标志物进行联合检测，W提高乳 腺癌诊断的阳性率。虽然联合检测优于单项检测已成共识，但并非任意一种组合均能提高 临床诊断的阳性率，在最佳组合上结论颇不一致，甚至出现相反的结果。因此，寻找一种高 灵敏度、高特异性、可实际应用于乳腺癌临床诊治的生物标志物已成为乳腺癌研究中亟待 解决的问题之一。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是:提供一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:一种用于乳腺癌诊断的miRNA 标志物，所述标记物包括 11111?-146日、11111?-155、11111?-21、11111?-222和11111?-339。
[0007] 在本发明的第二方面，提供了上述miRNA标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应 用。
[000引在本发明的第Ξ方面，提供了一种乳腺癌诊断试剂盒，其能够测定组织中的1111尺- 146a、miR-155、miR-21、miR-222 和 miR-339 的含量。
[0009] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miR-146a，miR-155，miR-21，miR-222 和miR-339的引物和探针。
[0010] 在本发明的一个优选例中，上述引物和探针针对的目标序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和沈Q ID NO.5所示。
[0011] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒中含有美国应用生物系统公司的引物探针 组合，其产品编号分别为000468、002623、000397、002276和002184。
[0012] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒中还含有内参RNU44。
[001引所述诊断试剂盒还可W包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液， dNTPs，MgCl2和肥PC水等;还可W含有标准品和/或对照品。
[0014] 上述人类乳腺癌诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂 是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，运些试剂的特性W及它们的配制方法均是 本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于）：阴性对照品、阳性对照品；还可W 包括巧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。
[0015] 可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分 析，溶液杂交检测等)测定相关miRNA在乳腺癌患者和健康人群中的水平;在本发明的具体 实施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0016] 在本发明的第四方面，提供了上述肺癌诊断试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0017] (1)从待测试样品中提取总RNA;
[0018] (2)将步骤(1)提取得到的总RNA使用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相 应的cDNA;
[0019] (3)将步骤(2)得到的cDNA进行实时巧光定量PCR，并WRNU44为内参，检测结果W Act表示，其中 Act = CtmiRNA-CtRNU44 ;
[0020] (4)将得到的结果代入公式ο. 987+0.032a-0.084b-0.061C+0.045d+0.004e中，将 计算值与0.709比较，如计算值大于0.709，则判断为乳腺癌;如计算值小于0.709，则判断为 非乳腺癌。其中a代表miR-146a的Act值，其中b代表miR-155的Act值，其中C代表miR-21的 Act值，其中d代表miR-222的Act值，其中e代表miR-339的Act值。
[0021] 本发明的有益效果在于:发明人通过广泛的文献调研，从公开发表的文献中筛选 出可能具有潜力的肿瘤标志物，并通过大量的实验和分析，首次发现了对乳腺癌具有较高 诊断价值的生物标记物miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339五种miRNA;通过 miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可W使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医 生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的 新型小分子药物祀标提供帮助。
【附图说明】
[0022] 图1为正常对照及乳腺癌组织中miRNA表达的R0C曲线图。
[0023] 图2为计算模型1所得预测概率的R0C曲线图。
【具体实施方式】
[0024] 一、研究对象
[0025] 病例组为2009年2月至2012年12月在常州市第二人民医院收集的96例乳腺癌病 例，均经病理组织学确诊，手术前未经化放疗。由于正常的医疗过程中无法取得健康女性的 乳腺标本，因此对照组采用同期的纤维囊性乳腺病患者的手术标本11例，取其中的正常组 织做为对照，按性别和年龄（±5岁）与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采 样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理。
[0026] 二、研究方法
[0027] (1)使用10%中性甲醒充分固定手术标本，脱水、石蜡包埋、切片、皿染色后，由病 理医师对切片进行组织学诊断，确定肿瘤组织、正常组织区域，并进行标记。
[00%] (2)按照石蜡组织总RNA快速提取试剂盒（美国QIAGEN公司）说明书从石蜡组织中 提取总RNA。
[0029] (3)按照miRNA逆转录试剂盒(TaqMan microRNA反转录试剂盒，货号NO. 1302146R， 美国ABI公司）说明书进行逆转录反应。反应总体积为15u 1 (总RNA加1，TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水4.16ul，RNase抑制剂0.19ul，缓冲液1.加1，]\11111:13(31'化日逆转录 酶 l.OOul 和 dNTP0.15ul)，在不同溫度下（16°(：，42°(：，85°(：，4°(：)进行不同时长（3〇1111113， SOmins，5mins，lOmins)反应。
[0030] (4)实时巧光定量PCR按照TaqMan试剂盒（TaqMan通用混合试剂盒11，货号 NO. 121207，美国ABI公司）说明书进行。PCR扩增体系总体积为1 Oul，反应共40个循环。PCR反 应Ct值通过7900实时巧光定量PCR仪(美国ABI公司）测定，每个反应重复Ξ次，WRNU44为内 参。检测结果W Act表示，其中Act = CtmiRNA-CtRNU44，Act值越大，表达量越低。
[00川 S、研究结果
[0032] 病例组 11111?-146日，11111?-155，11111?-21，11111?-222和11111?-339的水平显著高于正常对照 组，具体数据如表1所示：
[0033] 表1:正常乳腺(NC)及乳腺癌(BC)组织中microRNA表达水平(Act，均值±标准差）
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