特异性结合her3的抗体的制作方法
【专利说明】特异性结合HER3的抗体
[0001] 本发明设及分离的特异性结合人肥R3的抗体，使用运些抗体实施免疫组织化学的 方法，及生成它们的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 人皿 R3 化 rbB-3，ERBB3，c-erbB-3，c-erbB3，受体酪氨酸蛋白质激酶 erbB-3，SEQ ID NO: 17)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体化GFR)家族的一名成员，该家族还包 括肥Rl(也称作EGFR)，皿R2,和皿R4化raus，M.H.等，PNAS 86( 1989)9193-9197 ;Plowman， G.D.等，PNAS 87( 1990)4905-4909;Kraus，M.Η.等，PNAS 90(1993)2900-2904)。与原型表皮 生长因子受体一样，跨膜受体皿R3由胞外配体结合域化CD)，ECD内的二聚化域，跨膜域，胞 内蛋白质酪氨酸激酶域（TKD)和C端憐酸化域组成。此跨膜蛋白具有胞外域内的调蛋白 化RG)结合域而非活性激酶域。因此，它能结合此配体，但是不能经由蛋白质憐酸化将信号 传送入细胞中。然而，它确实与确实具有激酶活性的其它皿R家族成员形成异二聚体。异二 聚化导致受体介导的信号传导途径的激活及其胞内域的转憐酸化。皿R家族成员间的二聚 体形成扩大皿R3的信号传导潜力，并且是一种不仅用于信号多样化，而且用于信号放大的 手段。例如，肥R2/肥R3异二聚体在肥R家族成员间经由PI3K和AKT途径诱导最重要的促有丝 分裂信号之一（Sliwkowski，M. X.等，J. Biol. Chem. 269(1994) 14661-14665 ;Alimandi，M. 等，Oncogene.10(1995)1813-1821;Hellyer，N.J.，J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261; Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006) 613-622)〇
[0004] 已经在众多癌症(包括前列腺，膀脫，和乳腺肿瘤）中报告了此基因的扩增和/或其 蛋白质的过表达。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。
[000引一种同等型缺乏膜间区，并且分泌到细胞外。此形式作用为调控膜结合形式的活 性。还已经报告了别的剪接变体，但是它们尚未彻底表征。
[0006] 尽管事实是知道人肥R3已经超过二十年，但是在组织样品中检测蛋白质肥R3甚至 在今天仍然是极度困难的。然而，在组织样品中检测皿R3对于将给定样品的结构和形态及 皿R3的定位，组织分布和/或浓度与生物学功能(特别是设及众多癌症的病理生理背景)关 联起来是至关重要的。
[0007] 虽然能从多家公司作为科研试剂获得数种抗肥R3抗体，但是使用那些试剂看来不 可能获得令人满意的对组织样品的染色，尤其是已经福尔马林固定和石蜡包埋的组织样 品。特别地，需要在用于组织样品的自动化染色系统(诸如Ventana Benchmark XT)中使用 时显示针对肥R3的高结合特异性和灵敏度的抗体。
[0008] 本发明的任务是鉴定特异性结合人皿R3蛋白质且至少能部分克服本领域已知问 题的抗体。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明设及一种分离的结合人肥R3的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含重 链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR1H区， 包含SEQIDN0:2或SEQIDN0:3的氨基酸序列的CDR2H区，和包含SEQIDN0:4的氨基酸序 列的CDR3H区，且所述轻链可变域包含包含SEQ ID ^):5的氨基酸序列的〔01?化区，包含569 ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR化区，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的 CDR：3L 区。
[0011] 本发明进一步包含一种分离的结合人皿R3的抗体或其抗原结合部分，其具有重链 可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，且 所述轻链可变域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
[0012] 本发明还包含一种分离的结合人肥R3的抗体或其抗原结合部分，其具有重链可变 域和轻链可变域，所述重链可变域包含包含自SEQ ID N0:1通过一处或多处保守氨基酸替 代而修饰的氨基酸序列的CDR1H区，包含自SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3通过一处或多处保 守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR2H区，和包含自SEQ ID NO:4通过一处或多处保守 氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR3H区，且所述轻链可变域包含包含自SEQ ID N0:5通 过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR1L区，包含自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO :7通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR化区，和包含自SEQ ID N0:8通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR化区。在本发明的一个实 施方案中，CDR1L区包含自SEQ ID N0:5通过第5位处的保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序 列。在一个进一步的实施方案中，SEQ ID N0:5第5位处的保守氨基酸替代为苏氨酸/丝氨酸 替代。在本发明的另一个实施方案中，CDR化区包含自SEQ ID NO:8通过第6位或第9位处的 保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列，或者CDR化区包含自SEQ ID NO: 8通过第6位和第9位 处的保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列。在一个进一步的实施方案中，SEQ ID N0:8第6 位处的保守氨基酸替代为鄉氨酸/丙氨酸替代或SEQ ID NO:8第9位处的保守氨基酸替代为 丙氨酸/苏氨酸替代。在另一个实施方案中，CDR化区包含自SEQ ID NO:8通过第6位和第9位 处的保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列，其中SEQ ID N0:8第6位处的保守氨基酸替代为 鄉氨酸/丙氨酸替代且SEQ ID N0:8第9位处的保守氨基酸替代为丙氨酸/苏氨酸替代。
[0013] 本发明的另一个方面提供一种分离的结合人肥R3的抗体或其抗原结合部分，其中 该抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变域包含与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
[0014] 在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明的抗体是IgG亚类的抗体。
[0016] 令人惊讶地发现，本发明的任何上述抗体具有相当有益的特性，而且能克服至少 一些本领域已知问题。它们能W极大益处用于免疫组织学染色规程W检测人皿R3蛋白质。 尤其令人惊讶且值得一提的是，依照本发明的抗体产生卓越的染色结果，甚至是对福尔马 林固定石蜡包埋组织(FFPET)样品。因此，依照本发明的抗体对于在自动化染色规程中加工 的FFPET样品中检测人肥R3是特别有用的。
[0017] 因而，本发明还设及一种用于实施免疫组织化学的方法，该方法包括下述步骤:将 组织样品与依照本发明的抗体一起溫育，由此发生所述抗体对所述组织中的人皿R3的结 合，并对所述组织样品针对结合至该组织样品的抗肥R3抗体进行染色。
[0018] 在一个实施方案中，本发明设及依照本发明的抗体在人肥R3的免疫组织化学检测 中的用途，尤其是在甲醒固定石蜡包埋组织(FFPET)样品中。
[0019] 本发明的另一个实施方案设及对于方便实施人皿R3的免疫组织化学检测有用的 试剂盒。在一个实施方案中，提供用于在甲醒固定石蜡包埋组织(FFPET)样品中检测人肥R3 的试剂盒，所述试剂盒包含依照本发明的抗体或其抗原结合部分，和用于检测所述抗体或 其抗原结合部分的试剂。
[0020] 本发明的另一个方面提供一种编码本文中提供的抗肥R3抗体的重和轻链的核酸。
[0021] 在一个实施方案中，所述核酸编码抗皿R3抗体的重和轻链，其中重链可变域包含 包含569 10^:1的氨基酸序列的〔03巧区，包含569 10^:2或569 10^:3的氨基酸序列 的CDR2H区，和包含SEQIDN0:4的氨基酸序列的CDR3H区，且轻链可变域包含包含SEQID ^:5的氨基酸序列的〔03化区，包含56〇10^:6或56〇10^):7的氨基酸序列的〔01?化区， 和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR化区。
[0022] 在另一个实施方案中，所述核酸编码抗皿R3抗体的重和轻链，其中重链可变域包 含包含自SEQ ID NO: 1通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的CDR1H区，包 含自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的 CDR2H区，和包含自SEQ ID NO: 4通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的 CDR3H区，且轻链可变域包含包含自SEQ ID NO:5通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的 氨基酸序列的CDR1L区，包含自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7通过一处或多处保守氨基酸替 代而修饰的氨基酸序列的CDR化区，和包含自SEQ ID NO:8通过一处或多处保守氨基酸替代 而修饰的氨基酸序列的CDR化区。
[0023] 在又一个实施方案中，所述核酸编码抗皿R3抗体的重和轻链，其中重链可变域包 含沈Q ID NO:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，且轻链可变域包含沈Q ID NO: 11或沈Q ID NO :12的氨基酸序列。
[0024] 在另一个实施方案中，所述核酸编码抗皿R3抗体的重和轻链，其中重链可变域包 含与SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，且轻链可变域 包含与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
[0025] 本发明进一步包括表达载体，其包含依照本发明的核酸，用于在原核或真核宿主 细胞中表达依照本发明的抗体。
[0026] 本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
[0027] 本发明进一步包括一种用于生成依照本发明的重组抗体的方法，其特征在于在原 核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸，并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述 抗体。
[002引发明详述
[0029] 本发明设及一种分离的结合人皿R3的抗体或其抗原结合部分，其特征在于：重链 可变域包含包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR1H区，包含沈Q ID NO:2或沈Q ID NO:3的 氨基酸序列的CDR2H区，和包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的CDR3H区，且轻链可变域包含包 含569 10^:5的氨基酸序列的〔03化区，包含569 10^:6或569 10^:7的氨基酸序列的 CDR化区，和包含SEQ ID ^:8的氨基酸序列的〔03化区。
[0030] 本发明进一步包含一种分离的结合人皿R3的抗体或其抗原结合部分，其