用于在人ezh2基因中检测突变的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于在人EZH2基因中检测突变的方法和组合物 发明领域
[0001] 本发明设及癌症诊断学和癌症治疗的伴随诊断学。具体而言，本发明设及突变检 测，所述突变检测对于诊断和预后W及预测癌症治疗效果是有用的。
[0002] 发明背景 EZH2是祀向组蛋白的染色质修饰酶。具体而言，EZ肥蛋白为多梳抑制复合物2(PRC2)的 催化亚基，其为对组蛋白3(H3)的赖氨酸-27(Κ27)特异性的组蛋白甲基转移酶。甲基化的 Η3-Κ27与基因抑制相关。异常升高的ΕΖΗ2水平已在多种癌组织中发现且与基因抑制相关， 综述于Simon, J.,和Lange, C. (2008) Roles of EZH2 histone methyltransferase in cancer epigenetics, Mut.Res.647:21。还发现特定突变通过改变EZ肥蛋白的底物偏好而 改变其组蛋白修饰功能。在位置Y646处突变的EZH2(参见Wiggle, T.，等（2011) FEBS Lett. 585: 3011)在将二甲基化的H3化3K27me2)甲基化为Ξ甲基化形式化3K27me3)中有异 常活性。在位置A692处突变的EZH2(参见Majer, C.，等（2012) F邸S Lett, 586:3348)对二 甲基化是有异常活性的；且在位置4682处突变的62肥（参见1成曰66，1.，等（2012)，？麻8 109:2989)对所有Ξ个甲基化步骤是有异常活性的。在人癌症中，运些突变已显示促进经组 蛋白超甲基化的基因抑制。
[0003] 已发展了祀向EZH2的疗法。EZH2的选择性小分子抑制剂已显示阻断EZH2(和PRC2) 活性并促进体外杀死癌细胞化nutson, S,等（2012)化1:ure Qiem.Bio.8:890)。该抑制剂 对于杀死具有异常活性的突变体EZH2的细胞是独特有效的且不影响具有野生型EZH2的细 胞（同上）。因此，伴随诊断测试对于鉴定其肿瘤具有突变体EZH2且将可能从EZH2抑制剂中 受益的患者是必需的。EZH2突变的临床检测W足够的灵敏度祀向尽可能多的突变是有必要 的。运将保证具有稀有突变的患者不会接到"假阴性"的检测结果从而错过了有可能会保全 性命的治疗。同时，测试应是高度特异性的W确保患者不会接受"假阳性"结果且接受昂贵 且无效的治疗。
[0004] 灵敏并且适合多重处理的一种技术是等位基因特异性PCR (AS-PCR)。该技术在存 在序列的野生型变体的情况下检测核酸序列中的突变或多态性。在成功的等位基因特异性 PCR中，扩增目标核酸的所需变体，而其它变体不被扩增，至少不在可检测到的水平上。在等 位基因特异性PC帥，至少一条引物是等位基因特异性的，从而使引物延伸仅在存在序列的 特异性变体时进行。在相同的反应混合物中可W存在祀向一个或多个多态位点的一条或多 条等位基因特异性引物。设计成功的等位基因特异性引物是不可预知的技术。尽管对于已 知序列设计引物是很平常的，却不存在设计出可W区分非常相似的序列的引物的方案。
[000引在诊断测定的背景下，需要精确区分。例如，在EZH2突变检测的背景下，等位基因 特异性引物的性能可W决定患者癌症治疗的过程。因此，仍然需要具有最大特异性和灵敏 度的能够检测最大数目的EZH2突变的全面检测。
[0006] 发明概述 在一个实施方案中，本发明为用于检测人EZH2基因中的突变的分离的寡核巧酸，其由 选自对应于W下的SEQ ID NO的寡核巧酸的序列组成：EZH2_Y646N_R (SEQ ID N0:1)、 Y646H-R (沈Q ID N0:12)、Y646F_R (沈Q ID N0:21)、Y646C_R (沈Q ID N0:41)、A682G_R (SEQ ID N0:59)和A692V_R (SEQ ID N0:73)，例外是包含与人EZH2基因的天然存在的序列 的至少一个错配。SEQ ID肋3:1、12、21、41、59和73的每一个包含至少一个1'1'二联体 (duplet)和TTT或CTCS联体。任何所述SEQ ID NO的长度为20-30个核巧酸。在运些实施方 案的变化中，错配位于各个寡核巧酸的3'端的最后5个核巧酸内。在运些实施方案的进一步 变化中，所述寡核巧酸进一步包含至少一个非天然核巧酸。
[0007] 在另一个实施方案中，本发明为检测样品中的人EZH2核酸中的突变的方法，其包 括：（a)将样品中的核酸与上述选自对应于沈Q ID NO: 1、12、21、41、59和73的沈〇10^的 至少一个寡核巧酸接触；（b)将样品在允许寡核巧酸与EZH2核酸内的祀序列杂交的条件下 解育；（C)生成含有EZH2核酸内的祀序列的扩增产物;和(d)检测经扩增的产物的存在，由此 检测EZH2核酸中突变的存在。在该实施方案的变化中，样品中的核酸与选自表2-4中列出的 等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的寡核巧酸接 触。
[0008] 在另一实施方案中，本发明为测定患有恶性肿瘤的患者是否可能对EZH2抑制剂响 应的方法，包括：（a)将来自患者的样品中的核酸与选自表2-4中列出的等位基因特异性引 物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的至少一个寡核巧酸接触；（b)将 样品在允许寡核巧酸与EZH2核酸内的祀序列杂交的条件下解育;和生成含有EZH2核酸内的 祀序列的扩增产物；（C)检测经扩增的产物的存在，由此检测EZH2核酸中突变的存在，其中 存在突变表示患者可能对EZH2抑制剂响应。在该实施方案的变化中，所述寡核巧酸对于选 自位置Y646、A682和A692处的突变的至少两个是特异性的。在该实施方案的进一步变化中， 所述寡核巧酸对于选自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V处的突变的 至少两个是特异性的。
[0009] 在仍另一个实施方案中，本发明是检测人EZH2基因中的突变的试剂盒，所述试剂 盒包含选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至 少一个错配的至少一个寡核巧酸和任选地至少一种用于PCR的额外试剂。在该实施方案的 变化中，试剂盒包含SEQ ID N0:l-51、58-68和72-83中的两个或更多个。在该实施方案的进 一步变化中，所述试剂盒包含两个或更多个寡核巧酸，所述寡核巧酸各自对于选自位置 Y646、A682和A692处的突变是特异性的。在该实施方案的进一步变化中，所述试剂盒包含两 个或更多个寡核巧酸，所述寡核巧酸各自对于选自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、 A682G和A692V处的突变是特异性的。
[0010] 在仍另一个实施方案中，本发明是治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患 者施用合适剂量的EZH2抑制剂，其中所述患者的肿瘤携带有用选自表2-4中列出的等位基 因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的寡核巧酸检测到的 EZ肥基因中的体细胞突变。
[0011] 在仍另一实施方案中，本发明是治疗患有癌症的患者的方法，其包括使用选自表 2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的 至少一个寡核巧酸探测患者样品的EZH2基因中的突变，且如果发现突变，则向所述患者施 用一定剂量的EZH2抑制剂。在该实施方案的变化中，突变位于位置Y646、A682和A692。在该 实施方案的进一步变化中，突变选自Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V。在 该实施方案的进一步变化中，所述寡核巧酸选自SEQ ID NO: 1-51、58-68和72-83。在该实施 方案的进一步变化中，所述EZH2抑制剂选自EI1 EPZ6438化7438)、GSK343或GSK126。在该 实施方案的进一步变化中，所述癌症是淋己瘤。
[001引发明详述 定义 为了便于理解本公开内容，提供了本文使用术语的W下定义。
[001引术语^[n]r指在氨基酸序列中[η]位置上氨基酸X替换为氨基酸Y的错义突变。例 如，术语叮646C'指646位酪氨酸替换为半脫氨酸的突变。
[0014]术语"等位基因特异性引物'或"AS引物'指运样的引物，所述引物与多于一个目标 序列的变体杂交，但能够在仅具有目标序列的变体间区分开，因为仅对于一个变体，引物才 可W在合适条件下由核酸聚合酶有效延伸。对于目标序列的其它变体，延伸效率更低或是 无效的。
[001引术语"通用引物'指包括等位基因特异性引物的引物对中的第二条引物。通用引物 不是等位基因特异性的，即无法在等位基因特异性引物可W区分的目标序列的变体间进行 区分。
[0016] 术语巧补的"或巧补性'参考Watson-