br>[0031] 细胞系培养液的制备：由13.7g/l的L-15基础培养基分别添加 20.2g/l NaCl、 0.54g/lKCl、0.60g/l CaCl2、lg/l MgS〇4、3.9g/l MgCl2及5%的胎牛血清、2mmol/L的谷氨 酰胺、1 %的栉孔扇贝卵黄提取液、1 %的栉孔扇贝血清、1 〇〇 IU/ml的青霉素和100μg/ml的链 霉制成，pH为7.2-7.4。
[0032] 2)栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养 [0033] A)单细胞的获取
[0034]取性腺成熟的栉孔扇贝，按照常规的方法诱导配子排放、人工授精并培养到担轮 幼虫。离心浓缩加入无钙镁离子的磷酸盐缓冲液解离获得担轮幼虫的单细胞。
[0035] B)原代培养
[0036]将上述单细胞接种到培养皿中，加入lml完全培养液，启动原代培养，每天观察，根 据污染情况等及时更换完全培养液，原代培养两天时，对单细胞进行观察，其形态如图1所 不。
[0037] C)传代培养
[0038]如图2所示，当原代培养的细胞长出克隆后挑取克隆，实现早期传代，待传代培养 的细胞铺瓶率达到80 %时，使用机械吹打的方法以1:2的比例进行传代，成功建立栉孔扇贝 担轮幼虫细胞系。
[0039] 实施例2栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的特征分析
[0040] 1)形态描述
[0041] 栉孔扇贝担轮幼虫细胞第10代和50代显微镜照片如图3和图4所示，细胞形态为近 圆形，同时栉孔扇贝担轮幼虫细胞第10代Giemsa染色显微镜照片如图5所示，显示核质比 大，细胞增殖旺盛，局部有克隆团。
[0042] 2)生长曲线
[0043]取增殖稳定，约6d传代一次的45代担轮幼虫对数期细胞，调整细胞密度为5 X 104/ ml，以lml/孔的量接种于24孔板中进行培养。每隔24h取出3个孔进行计数，连续进行10d，以 培养时间（d)为横坐标，以细胞浓度为纵坐标(细胞/ml)，进行生长曲线的绘制，根据公式T = tXlg2/lg(Nt/N〇)计算其群体倍增时间(T)，其中No为起始接种的细胞数，Nt为培养t时间 后的细胞数。
[0044]结果如图6所示，该细胞系生长曲线正常，计算得群体倍增时间为T = 75.6h。
[0045] 3)冻存与复苏
[0046] 取第30代对数生长期的栉孔扇贝担轮幼虫细胞，将106的细胞1500r离心10min，以 l·5ml冻存保护液(90%L15完全培养基和10%DMS0)重悬，置于程序冻存盒（Na丨gene?Mr· Fr〇Sty'?_Cryo 1°C Freezing Containers)在_80°C冰箱中过夜进行梯度降温，最后在液氮 中长期保存。
[0047]取出液氮中的冻存管，迅速置于37°C水浴中，使冻存保护液溶解，1500r离心5min， 弃保护液，加入1.5ml新鲜培养基重悬细胞，取少量细胞进行台盼蓝染色，其余细胞于23 °C 生化培养箱中进行培养，12h后更换培养基。
[0048]台盼蓝染色并计数显示，约90%以上的细胞成活。细胞在经过2d适应后恢复增殖 能力，开始有贴壁的克隆出现，6d后进行正常传代。
[0049] 4)细胞种属的分子鉴定
[0050] 提取栉孔扇贝担轮幼虫第26代细胞和栉孔扇贝鳃组织基因组DNA为模板，依据扇 贝保守的18S与28S rRNA序列设计引物，正向引物序列：5 '-GTTTCTGTAGGTGAACCTG-3 ' ；反向 引物序列：5'-(：1^1'0^1'0^661^6六-3'，扩增栉孔扇贝特异的1了5(185与283冰祖内转 录间隔区）片段。PCR 扩增条件：94￡€511^11，941€3〇8,541€3〇8,72°(：11^11，30循环，72°(：1〇1^11。 取1.5μ1 PCR产物用1.5 %琼脂糖电泳分离，EB染色，紫外检测拍照。
[0051] 如图7所示，栉孔扇贝担轮幼虫第26代细胞和栉孔扇贝鳃组织均扩增得到目的条 带(741bp)说明体外培养的细胞来自于栉孔扇贝并且在体外培养过程中该ITS区域长度未 发生变化。
【主权项】
1. 一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所述的培养基包括以下 组分：13.7g/l的L-15基础培养基、20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、lg/l MgS〇4、3.9g/l MgCl2及终浓度为5%的胎牛血清、2mmol/L的谷氨酰胺、1%的栉孔扇贝卵黄 提取液、1 %的栉孔扇贝血清、l〇〇IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，pH为7.2-7.4。2. 根据权利要求1所述的一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所 述的栉孔扇贝血清通过以下方法制备:于闭壳肌中抽取栉孔扇贝血淋巴，置于无菌容器中4 °(：静置过夜，次日将上清液以2000g离心10min，收集上清后分别经0.45μπι和0.22μπι孔径的 微孔滤器过滤除菌，分装后置于_20°C保存。3. 根据权利要求1所述的一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所 述的栉孔扇贝卵黄提取液通过以下方法制备:解剖成熟期的栉孔扇贝卵巢，置于灭菌的海 水中清洗3遍，用剪刀将卵巢剪碎至乳糜状;取lml乳糜状的组织到15ml离心管中，加入10ml 无钙镁离子磷酸盐缓冲液;冰上超声破碎3min，功率200W;结束后静置5min，再4°C，8000g， 离心lh;收集上清液经0.45μπι、0.22μπι微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管lml，封 膜，冻存备用。4. 根据权利要求3所述的一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所 述的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液通过以下方法配置:〇. 2g/l KC1、0.2g/l KH2P〇4、30g/l、 2.168/1似2冊〇4.7出0的水溶液，使用超纯水作为溶剂，调节?!1至7.2-7.4后高压灭菌，置 于4°C保存。5. -种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，利用权利要求1所述培养基 进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养。6. 根据权利要求5所述的一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于， 1) 单细胞的获取 取性腺成熟的栉孔扇贝，诱导配子排放、人工授精并培养到担轮幼虫，离心浓缩加入无 钙镁离子的磷酸盐缓冲液解离获得担轮幼虫的单细胞； 2) 原代培养 将获得的单细胞接种到培养皿中，加入lml权利要求1所述培养基，启动原代培养； 3) 传代培养 当原代培养的细胞长出克隆后挑取克隆，实现早期传代，待传代培养的细胞铺瓶率达 到80%时，使用机械吹打的方法以1:2的比例进行传代，完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细 胞的传代培养，成功建立栉孔扇贝担轮幼虫细胞系。
【专利摘要】本发明公开了一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基及方法，该培养基包括以下组分：13.7g/l的L-15基础培养基、20.2g/l？NaCl、0.54g/l？KCl、0.60g/l？CaCl2、1g/l？MgSO4、3.9g/l？MgCl2及终浓度为5％的胎牛血清、2mmol/L的谷氨酰胺、1％的栉孔扇贝卵黄提取液、1％的栉孔扇贝血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，pH为7.2-7.4。所述的培养方法为利用所述培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养。本发明培养基可有效地提高细胞的存活，可使细胞持续增殖，并且该方法对其它海洋贝类细胞系的建立具有指导意义，应用价值极大。
【IPC分类】C12R1/91, C12N5/07
【公开号】CN105602887
【申请号】CN201510801587
【发明人】张志峰, 季爱昌, 李学玉, 秦贞奎, 马晓世, 杨丹丹
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年11月19日