一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物细胞培养领域，尤其涉及一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方 法。
【背景技术】
[0002] 胚胎干细胞的研究遇到伦理、法律的瓶颈之后，成体干细胞日益成为研究的热点。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于脐带血、骨髓、肌肉、皮肤和脂肪 等组织中的一类成体干细胞，MSCs来源可靠，具有自我更新，且具有向多种组织分化潜能， 可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，脂肪干细胞) 是近年来从脂肪组织中分离得到的一类成体间充质干 细胞，具有自我更新及向分化潜能。脂肪干细胞由于具有安全、易获得、可迅速扩增和多向 分化能力等特点使其成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。目前临床上已利用这种 细胞进行基因治疗、干细胞治疗及骨组织工程的修复等，在再生医学领域具有广泛的应用 前景。
[0003] 2006年，国际细胞治疗协会（间充质干细胞委员会）（Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy)认为人 类的MSCs的必须满足以下三个条件：（1)在标准的细胞培养条件下，MSCs必须具备可贴壁性 生长；（2)MSCs应该高表达0)73、0)90、0)105 ;而应低表达或不表达0)14、0)45、0)1113、0)34、 CD79、CD 19以及人白细胞抗原(HLA-DR)。（ 3)在特定的诱导液培养下，MSCs必须具有向骨、月旨 肪和软骨分化的能力。由于目前脂肪干细胞并没有特定的表面标志，因此对它们的鉴定主 要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和将脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨的诱导分化 来确定它们是否为脂肪干细胞。这是目前公认的间充质干细胞鉴定方法。
[0004] 在现有技术中，猪脂肪干细胞在体外连续培养后，容易老化，核型发生改变、表面 抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪细胞方向分化(Zhang et al.(2014).PLoS ONE 9(1)：e85089.doi：10.1371/journal. pone .0085089；Huang et al. Stem Cell Research&Therapy (2015)6:77)，没有向成软骨细胞方向诱导成功的报道。 脂肪干细胞的老化限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种遗传稳定性好，干性好，多向分化性能好的 脂肪干细胞培养的方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] -种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细 胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，
[0009] 所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37°C，时间为1~3h;所述的 Liberase TL的浓度为15~25yg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为Ο·5~1:1;
[0010] 2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
[0011]优选的，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：
[0012]采集猪脂肪组织；
[0013]将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45~ 0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L链霉素的PBS溶液。
[0014]优选的，所述的脂肪组织消化后还包括终止消化，所述终止消化具体为：
[0015]使用含体积分数为7.5~15%FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的低糖DMEM培 养液为葡萄糖含量低于l〇〇〇mg/L的DMEM培养液。
[0016] 优选的，所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过 滤；
[0017] 所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100M，所述第二细胞筛过滤中细胞筛的 孔径为70μηι。
[0018] 优选的，所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心；
[0019] 所述第一离心的转速为1000~1400rpm，所述第一离心的时间为8~12min;
[0020] 所述第二离心的转速为8000~1200rpm，所述第二离心的时间为8~12min。
[0021 ]优选的，所述传代培养采用的培养液为含有体积分数为7.5~15 % %FBS的低糖 DMEM培养液，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。
[0022] 本发明还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
[0023] 将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。
[0024]优选的，所述生物学特性鉴定包括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。
[0025] 优选的，所述脂肪干细胞表面抗原检测前还包括:将所述脂肪干细胞依次进行预 消化和消化；
[0026] 所述预消化采用Liberase TL进行，所述Liberase TL的浓度为15~25yg/mL，所述 预消化的温度为37°C，所述预消化的时间为1~3min，
[0027] 所述预消化的环境中的C02的体积比例为5%，所述预消化的环境中的湿度为饱和 湿度；
[0028]所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25 %，所述 Η)ΤΑ的质量浓度为0.03~0.05%，所述消化的温度为37°C，C02饱和湿度为5%，所述消化的 时间为1~3min。
[0029] 优选的，所述的脂肪干细胞诱导分化检测，包括以下步骤：
[0030] 培养猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80 %-90%时，加入成脂诱导液、成骨诱导 液和成软骨诱导液进行为期2~4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导；
[0031] 将诱导培养到期的细胞分别进行油红0、茜素红和阿尔新蓝染色；
[0032]将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因 Ppar-2、成骨特异性基因 Osteocalcin和成软骨特异性基因 Collagen II检测；
[0033]所述的油红0、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因 Ppar-2、成骨特异 性基因 Osteocalcin和成软骨特异性基因 Collagen II检测之间无时间顺序限定。
[0034]本发明的有益效果:本发明提供方法所得到的脂肪干细胞体外连续培养到15代， 细胞增殖力强，仍然保持遗传稳定性;所得到的脂肪干细胞干性好，体外培养传代到第18代 仍具有间充质干细胞表面抗原特性（CD90+、CD44+、CD29+、CD105+、CD31-、CD45mHLA-DR-);尤其是不表达HLA-DR，说明脂肪干细胞无免疫排斥反应;所得到的脂肪干细胞的多向 分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。本发明的方法操作简 单、方便实用、可重复性强，建立了一套规范标准的猪脂肪干细胞的分离、培养和鉴定的方 法，为今后利用脂肪干细胞建立模式动物，研究人类疾病、器官移植、家畜常见疾病，以及在 提高优良家畜繁殖力，定向改造家畜遗传性状等研究奠定了基础。
【附图说明】
[0035]图1为本发明实施例2广西巴马小型猪脂肪干细胞P3、P5、P10和P15不同代数下的 生长曲线；
[0036]图2为广西巴马小型猪P3脂肪干细胞在21天时吉姆萨染液染色后得到的细胞集落 图；其中A，B和C分别表不常光、显微镜40 X和100 X的不意图；
[0037]图3为广西巴马小型猪脂肪干细胞的核型分析图（2n = 28);
[0038]图4为猪脂肪干细胞向成脂、成骨和成软骨方向分化图；
[0039]图5为广西巴马小型猪脂肪干细胞特异性基因检测结果；其中，M1、M2、M3为 DL500Marker，2、5、8为阳性对照GAH)H(230bp)，3、6、9为空白对照；1:PPAR-2(238bp)，4: 0steocalcin(205bp),7：Collage II(240bp)；
[0040] 图6为广西巴马小型猪脂肪干细胞P6代的表面抗原的流式检测结果图；
[0041] 图7为广西巴马小型猪脂肪干细胞P12代的表面抗原的流式检测结果图；
[0042]图8为广西巴马小型猪脂肪干细胞P18代的表面抗原的流式检测结果图。
【具体实施方式】
[0043] 本发明提供了一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
[0044] 1)将猪脂肪组织消化、离心后进行细胞培养；
[0045] 2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
[0046]本发明对所述猪的种类没有特殊的限定，优选的为广西巴马小型猪，广西巴马小 型猪是广西地方品种猪，其体型小，解剖结构、组织、生理等方面与人类相似，是较好的实验 动物模型。
[0047]本发明将猪脂肪组织进行消化，优选在消化前进行如下步骤：
[0048]采集猪脂肪组织；
[0049] 将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45~ 0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L链霉素的PBS溶液。
[0050] 本发明优选的首先采集猪脂肪组织，所述采集优选具体为：
[0051]用体积分数为75%酒精消毒广西巴马小型猪的腹部，然后从腹部采集脂肪组织。 [0052]采集到猪脂肪组织后，本发明将所述采集到的猪脂肪组织清晰后剪碎。在本发明 中，所述清洗用清洗液优选为含有〇. 45~0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L链霉素的PBS溶液， 所述的PBS溶液的pH值优选为7.2~7.4，更优选的为7.3;所述清洗的次数优选为2~4次；
[0053]本发明将清洗干净后的脂肪组织优选剪碎成1 X 1 X (1~3)_的小块。
[0054] 得到小块脂肪组织后，本发明优选将所述小块脂肪