一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种淋巴细胞的培养方法，特别涉及一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特 异性细胞毒性Τ淋巴细胞的培养方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 免疫细胞治疗是治疗癌症的新的一种治疗手段，2008年，美国贝勒医学院提出DC 疫苗组合专利申请：沉默免疫负调控基因技术（inhibition of Antigen Presentation Attenuators，iAPA)俗称"癌怕"技术，就是利用小干扰核糖核酸(siRNA)特异性阻断DC细胞 中关键的负调节因子S0CS1基因，使其基因表达沉默，诱导机体突破自身对肿瘤的免疫耐 受，增强抗原特异性免疫反应，进而提高肿瘤免疫治疗的临床疗效。与传统的DC-CIK细胞相 比，iAPA技术能够阻止DC细胞进入免疫耐受状态，促进CTL特异性免疫活性的获得。而且， iAPA腺病毒载体中含有癌细胞高效表达的肿瘤抗原基因 Survivin和MUC1，Survivin是凋亡 抑制蛋白家族成员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖 及浸润转移密切相关;MUC1在多种肿瘤中异常表达，主要表现为:①表达量增高，可达正常 时的100倍以上；②细胞表面分布的改变，极性分布丧失，整个细胞表面均表达;③结构改 变，主要由于糖基化不全，出现新的糖链及肽表位。主要组织相容性复合体MHC将肿瘤抗原 蛋白呈递在DC表面，激活肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞，增强CTL抗癌靶向性;鞭毛 蛋白基因可以可操作地连接至信号前导序列，用于分泌，并随后以自分泌和旁分泌的方式 结合到DCs上的表面TLR5(Toll-like rec印tor 5)，激活DC细胞病原菌识别能力。
[0003] 沉默免疫负调控基因（iAPA)技术是一种新型的肿瘤免疫细胞治疗技术。研究发 现，经沉默免疫负调控技术处理的树突状细胞联同细胞毒性T淋巴细胞(iAPA-DC/CTL)经瘤 体局部和静脉注射后，可有效抑制人肝癌细胞系HepG2细胞小鼠皮下移植瘤的生长。瘤体局 部注射的iAPA-DC可有效呈递肿瘤抗原，并趋向引导经尾静脉注射的CTL向瘤体组织的迀 移，产生杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长与迀移的作用。
[0004] 统观现有技术不难发现，现有技术存在很多不足之处:现有免疫细胞治疗中应用 的免疫细胞主要包括^、疆、1^、0(：-(：11(，是免疫细胞的一类，但是其抗原特异性低，对肿 瘤细胞的靶向性低；iAPA-DC/CTL技术具有一定的抗原特异性，但是CTL单纯在体外增殖，不 具有肿瘤抗原特异性;而且，受血液成分单采机的限制，不是每个医院都能够实现单个核细 胞的采集，产生局限性;肿瘤病人自体免疫较弱，一次性抽取大量免疫细胞可能会对患者造 成更坏的影响。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、操作稳定、对患者无伤害 的经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养方法。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养方法，以癌症患 者的脐血或自体外周血为处理对象，包括如下步骤：
[0008] (1)从脐血或自体外周血中分离出单个核细胞，重悬于X-VIV015培养基中静置培 养；
[0009] (2)将培养单个核细胞的培养瓶晃动，分离贴壁细胞和未贴壁细胞，将贴壁细胞诱 导为未成熟DC细胞；
[0010] (3)将未成熟DC细胞通过iAPA腺病毒因子转染并诱导为成熟DC细胞；
[0011] (4)将成熟DC细胞和T细胞混合共培养，连续刺激得到CTL细胞；
[0012] (5)将经DC细胞激活的CTL细胞进行增殖培养。
[0013] 本发明在现有细胞治疗细胞培养模式的基础上，发明了一种具有肿瘤抗原特异性 细胞毒性T淋巴细胞细胞(命名为i APA-DC-CTL细胞)培养方法。取150-200mL脐血或自体外 周血进行单个核细胞分离，贴壁2h分离培养DC细胞，未贴壁细胞于含IL-2的培养基中进行T 淋巴细胞预养。DC细胞经iAPA因子腺病毒感染诱导成熟后，收集成熟DC，按照DC:T为1:10的 效靶比刺激自体原初T淋巴细胞，使其分化为细胞毒性T淋巴细胞，观察记录CTL的增殖能 力、检测CTL的细胞毒性。
[0014] 本发明的更优技术方案为：
[0015] 步骤(1)的主要操作为：
[0016] ①将采血袋经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，利用50ml注射器抽 取血袋中的血液分装到50ml离心管中，每管血液30ml，经2000rpm下离心10min;
[0017] ②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止， 若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；
[0018] ③用生理盐水按照1:1的比例稀释白细胞，取装有15ml ficoll的离心管并倾斜， 缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超 过2:1，于常温1600rpm下离心20min;
[0019] ④离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸 弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，1500rpm 下离心10min;
[0020] ⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用5ml生理盐水重悬，再加生理盐水至45ml，混匀，取 样用于计算细胞数量，1300rpm下离心10min;
[0021] ⑥离心后弃上清，用X-VIV015培养基将细胞密度调整为107/ml。
[0022] 步骤的（2)的主要操作为：
[0023] ①将细胞密度为107/ml的脐带血单个核细胞按照106/cm2的细胞数量加入到培养 瓶中，37 °C、7.5 % C02浓度培养箱中培养；
[0024]②静置培养2h后，轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞至于 新的培养瓶中，加入含GMCSF 1000U/ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培养基，于37°C、7.5% C02浓度培养箱中培养；
[0025] ③第二天晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸弃培养液，重新补入含GMCSF 1000U/ ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培养基继续培养；
[0026] ④每隔两天半量换液，加入含GMCSF 1000U/ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培养 基，第5天完成未成熟DC细胞的培养，收集细胞，取样进行流式检测细胞表型。
[0027]步骤(3)的主要操作为：
[0028]①收集培养至第5天的未成熟DC细胞，取样计数，计算DC的总量，1500rpm，离心 lOmin；
[0029] ②离心后弃上清，加入含l〇〇〇U/ml GMCSF、1000U/ml IL-4和 100ng/ml TNF-α的X-VIVO 15培养基重悬细胞，将细胞密度调整为5X10%1，按照M0I为104vp/cell的病毒用量 加入细胞悬液，充分混匀，铺于培养瓶中，37 °C、7.5 % C02浓度培养箱中培养；
[0030] ③培养48h后，收集悬浮细胞，将未悬浮细胞用细胞刮刀刮起，混匀两种细胞为成 熟DC细胞，取样计数，进行流式检测细胞表型；
[0031] ④根据T细胞量确定DC需求量，将剩余的成熟DC重悬于含10%DMS0的FBS中，程序 降温法进行冻存。
[0032]步骤(4)的主要操作为：
[0033]①原初T细胞的预养，单个核细胞中未贴壁细胞置于含1000U/ml IL-2的X-VIV0 15培养基中作为原初T细胞预养，每两天补加培养基；
[0034]②收获na'ive-T细胞，取样计算T细胞总量。将DC与T细胞按照1:20的比例混合培 养，同时加入终浓度为l〇ng/ml的IL-7、2ng/ml的IL-15、lng/ml的IL-12,在含1000U/ml的 IL-2X-VIV0 15培养基中，于37°C，7.5%二氧化碳培养箱中培养；
[0035]③DC与T细胞共培养至第4天，复苏冻存的DC细胞，加入到DC-T细胞混合培养体系 中，再次刺激T细胞生长，同时加入IL-7 10ng/ml、IL-15 2ng/ml、IL-12 lng/ml，在IL-2 1000U/ml的X-VIVO 15培养基中，37°C，7.5%二氧化碳中培养。
[0036]步骤(5)的主要操作为：
[0037] 待DC细胞与T细胞共同培养至第7天，将T细胞转入含anti-CD3mAbs 5ug/ml、 antiCD28 mAbs 2ug/ml、IL-2 1000U/ml的X-VIVO 15培养基中进行扩增培养，并根据T细胞 生长情况进行补液，使Τ细胞生长密度保持为1 X 106/ml。
[0038]本发明中一些常用的术语说明如下：
[0039] GMCSF:巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子，
[0040] IL-4:白细胞介素-4，
[0041] IL-2:白细胞介素-2，
[0042] anti-⑶3mAbs:细胞表面分子3单克隆抗体，
[0043] anti-CD28mAbs:细胞表面分子28单克隆抗体，
[0044] TNF-α :肿瘤坏子因子-α，
[0045] Μ0Ι:感染复数，
[0046] IL-12:白细胞介素-12，
[0047] IL-7:白细胞介素-7，
[0048] IL-15:白细胞介素-15。
[0049]本发明所述CTL细胞抗原特异性检测方法为:在DC细胞将抗原呈递给Τ细胞时，形 成HLA-抗原-TCR三联体，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是天然的 抗原表位。因此，体外人工合成TCR结合的配体-HLA抗原肽四聚体（HLA-pept i de tetramer)。利用HLA-抗原肽四聚体和流式细胞分选仪能够从淋巴细胞中分离出抗原特异 性的T细胞克隆，结合T细胞培养，能够扩增相应的T细胞克隆。我们利用CD8-PE标记细胞毒 性Τ淋巴细胞和肿瘤特异性表面抗原survivin-HLA(LTLGEFLKL-HLA-A*02:01-APC)鉴定CTL 细胞肿瘤抗原survivin特异性。
[0050]本发明所述CTL细胞毒性检测方法为:将效应细胞与癌细胞按一定比例（10:1，20: 1，50:1)混合共培养，24h后收集细胞，离心洗涤，进行流式细胞检测CTL细胞毒性。正常细胞 的磷酯酰丝氨(phosphatidylserine，PS)位于细胞膜内表面，细胞凋亡(Apoptosis)时翻转 露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效 应细胞特异性单克隆抗体(如⑶8-FITC)标记效应细胞，再用APC-annexin V标记凋亡靶细 胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分 比。
[0051 ]本发明通过腺病毒转染进行基因改造的肿瘤特异性树突状细胞，在体外激活扩增 获得大量肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，获得更好的治疗效果;能够解决血液成分单采机 的限制，采集的血量少，减轻患者的负担，并且能够在体外观察iAPA-DC刺激原初T细胞分化 为肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞，并对其增殖能力和细胞毒性进行检测，避免了肿瘤细 胞对iAPA-DC可能产生的免疫逃逸。 (四）
【附图说明】
[0052]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0053]图1为经诱导5天的脐带血来源的未成熟树突状细胞(200 X )示意图；