的可溶性淀粉，40°C水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图1结果所示，确定较优固定化酶浓度为20U/mL。
[0034]实施例3:不同pH对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响
[0035]将粉状的糖化酶用pH为3.5?5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮载体，加入到1mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于室温条件下吸附2h，固定化结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入1mL 2 %的可溶性淀粉，40 °C水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图2结果所示，确定较优底物溶液pH为5.0.
[0036]实施例4:不同吸附温度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响
[0037]将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮载体，加入到1011^浓度为201]/11^的游离酶溶液中，分别在4°C、25°C、40 °C、60°C条件下吸附2h，固定化结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入10mL2 %的可溶性淀粉，40°C水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图3结果所示，确定较优吸附固定化温度为25°C。
[0038]实施例5:不同吸附时间对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响
[0039]将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮载体，加入到1mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25°(:条件下分别吸附0.5?3.0h，固定化结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入1mL 2%的可溶性淀粉，40°C水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图4结果所示，在吸附1.5h后固定化酶活力已基本达到稳定。
[0040]实施例6:不同戊二醛浓度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响
[0041 ]将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮载体，加入到1mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25°C条件下吸附1.5h，过滤掉剩余游离酶后，加入1mL浓度为0.5 %?2.5%的戊二醛溶液，交联20min，交联结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的戊二醛溶液。加入1mL 2 %的可溶性淀粉，40°C水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图5结果所示，戊二醛浓度为I %时固定化酶活力相对较高。
[0042]实施例7:改性柚皮载体固定糖化酶的重复利用性
[0043]将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮载体，加入到1mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25°C条件下吸附1.5h，过滤掉剩余游离酶后，加入1mL浓度为0.5 %?2.5%的戊二醛溶液，交联20min，交联结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的戊二醛溶液。加入1mL 2%的可溶性淀粉，40°C水解反应20min，同样步骤测酶活力，以测定其酶活回收率。根据图6结果所示，重复使用4次后，酶活回收率为38%。
[0044]本领域的普通技术人员从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、游离酶制备: 将粉末状糖化酶用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解混匀后，纱布过滤，取滤液即为游离糖化酶溶液； 步骤二、固定化载体制备: I)、取干燥的柚皮内层白色部分，切成丁状;2)、将柚皮按1:10(w/v)加入到pH 4的蒸馏水中，持续搅拌3.5h，结束后抽滤，滤渣用蒸馏水洗至中性;将滤渣按固液比1:10加入到质量分数为3%的氢氧化钠溶液中，持续搅拌3.5h，结束后抽滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，再用无水乙醇洗涤数次，60 °C干燥;3 )、将干燥的柚皮加入琥珀酸酐，吡啶回流24h，结束后用2M的盐酸溶液洗脱，再用蒸馏水洗涤数次，干燥得到改性柚皮载体，作为后续的固定化载体； 步骤三、固定化酶的制备: 将游离糖化酶与步骤二中制得的改性柚皮载体混匀直接固定化，再用戊二醛交联固定化糖化酶，待固定化完全后，采用纱布过滤，改性柚皮载体用缓冲液或蒸馏水洗涤数次直至表面无残留游离糖化酶为止，即得改性柚皮固定化糖化酶。2.如权利要求1中所述的一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，其特征在于:所述步骤一中乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为5.0，浓度为0.2mol/L，体积为1mL;溶解的糖化酶采用4层纱布过滤。3.如权利要求1中所述的一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，其特征在于:所述步骤二中柚皮切成丁的大小为2mm X 2mm X 2mm的立方体。4.如权利要求1中所述的一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，其特征在于:所述步骤三中将浓度为20U/mL的游离糖化酶与改性柚皮载体按20:1的比例混匀，于25°C直接吸附游离的糖化酶，吸附时间为1.5h，再用1mL浓度为I %的戊二醛溶液交联固定化糖化酶20min;待固定化完全后，纱布过滤，改性柚皮载体用pH 4.6浓度为0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液或蒸馏水洗涤数次直至表面无残留游离糖化酶为止，即得改性柚皮固定化糖化酶。5.如权利要求1中所述的一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，其特征在于:所述步骤三制备的固定化糖化酶重复使用4次后残余酶活为38%。
【专利摘要】本发明公开了一种改性柚皮固定化糖化酶的方法。该方法包括：(1)将切成丁状的柚皮进行酸处理和碱处理，以除去柚皮中的果胶、木质素和半纤维素等组分，得到预处理柚皮；(2)预处理后的柚皮用琥珀酸酐进行改性，在柚皮纤维上引入羧基，得到改性柚皮载体；(3)以改性柚皮为固定化载体，在酸性条件下对糖化酶进行吸附交联固定化，将游离的糖化酶固定在改性柚皮上；(4)通过调节游离酶浓度、固定化温度、吸附时间、戊二醛浓度等一系列因素优化改性柚皮固定化糖化酶实验工艺。本发明的优点为将柚皮变废为宝，达到了糖化酶重复使用的效果，工艺简单，产物易于分离，可操作性高，对环境的污染小，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N11/02
【公开号】CN105602927
【申请号】CN201610048622
【发明人】肖安风, 余倩, 姜泽东, 许彩云, 朱艳冰, 倪辉, 蔡慧农, 杜希萍, 杨秋明, 吴昌正
【申请人】集美大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月25日