一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组 体的构建方法。
【背景技术】
[0002] 随着建筑交通发展和生活压力大，发生外伤性脑损伤的比例日益增加，目前尚无 良好的药物治疗办法。大量的研究发现，一类分子量较小的神经生长因子能有效维持发育 中神经元存活，并加速细胞增殖和分化，且能促进损伤神经元的细胞修复和促进神经再生。 这种作用在体外较为明显，在体内也有报道，但迄今为止神经生长因子治疗脑损伤仍未广 泛展开，存在的主要问题是生长因子组蛋白提取困难，且进入体内后半衰期短，且不易透过 血脑屏障，这些问题阻碍了生长因子对中枢神经损伤中临床应用治疗。因此需要建立一种 高效表达神经生长因子的释放技术，用于脑损伤的治疗。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建 方法，旨在解决生长因子重组蛋白提取困难的问题。
[0004] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种中枢神经组织细胞 高效表达生长因子重组体的构建方法，构建方法以HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长 因子重组体，包括了以下步骤：
[0005] 非复制性HSV-1载体骨架构建：将野生的HSV-1 CL-1株利用同源重组方法删除 1〇卩27、扣?4、扣?34.5基因，构建出非复制，低毒性的批￥-1载体，并命名为似01载体；
[0006] 补偿细胞系筛选及培养:将HSV-1 ICP27基因构建到含有新霉素筛选标记的质粒， 转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为Vero HSV-1 CL-1-ICP 27细胞系；将HSV-1 ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染 Vero HSV-1 CL-1-ICP 27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系， 并命名为0G01细胞系；
[0007] pNX-CMV中间质粒构建:分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同 源序列设计引物，携带Sail和Xbal酶切位点，通过Sail和Xbal酶切LAT的同源序列将之构建 到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒;然后CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切位 点，通过SphI和Ps?酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上;WPRE元件根据设计的引物携带 EcoRI和Clal，通过EcoRI和Clal酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上;PolyA元件根据设计的 引物携带EcoRV和BglII酶切位点，通过EcoRV和BglΠ 酶切将PolyA元件构建到pNX质粒上， 并命名为pNX-CMV中间质粒。pNX-CMV-生长因子质粒构建:根据生长因子基因设计引物，携 带Hindlll和Xhol酶切位点，PCR扩增生长因子基因片段，Hindlll和Xhol酶切生长因子基因 片段，与同样酶切处理的pNX-CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；
[0008] 非复制性HSV-1载体构建:pNX-CMV-生长因子质粒DNA和非复制性HSV-1载体骨架 DNA使用磷酸钙共沉淀法共转染OGO1细胞系，挑取阳性病毒斑;将PCR验证目的基因重组正 确的病毒斑扩大培养，使用凝胶柱纯化，超滤管超滤，获得高滴度，非复制性的HSV-1载体。
[0009] 其中，删除10?27、10?4、10?34.5基因的方法为使用基因敲除或者基因置换，生长 因子为大鼠神经生长因子，并且用GFP标记同时克隆入HSV。
[0010]其中，0G01 细胞系使用含有 10%NBS、800ug/ml新霉素和700ug/ml Zeozin的DMEM 培养。
[0011] 本发明具有以下有益效果：
[0012] 1.本发明通过提出了一种基于HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组 体的方法，并且公开了构建方法的具体步骤和相关参数。
[0013] 2.经过合理本发明HSV减毒灭活载体可携带高表达4-5倍的生长因子，HSV携带生 长因子重组体转染神经元效率高达95%，具有良好的感染性;HSV-神经生长因子治疗外伤 性脑损伤有明显疗效，可改进神经功能。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明中HSV-ι生长因子重组体构建示意图。
[0015]图2为本发明中HSV-ι生长因子重组体在体外、体内表达水平图。
[0016] 图3为本发明实施例2中NSS评分结果图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。
[0018] 实施例1
[0019] 如图1所示，本发明公开了一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构 建方法，构建方法以HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体，包括了以下步骤：
[0020] 非复制性HSV-ι载体骨架构建:将野生的HSV-1CL-1株使用基因敲除或者基因置换 删除扣?27、扣?4、扣?34.5基因，构建出非复制，低毒性的批￥-1载体，并命名为似01载体；
[0021] 补偿细胞系筛选及培养:将HSV-1 ICP27基因构建到含有新霉素筛选标记的质粒， 转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为Vero HSV-1CL-1-ICP 27细胞系；将HSV-1 ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染 Vero HSV-1CL-1-ICP 27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系， 并命名为0G01细胞系；
[0022] pNX-CMV中间质粒构建:分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同 源序列设计引物，携带Sail和Xbal酶切位点，通过Sail和Xbal酶切LAT的同源序列将之构建 到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒;然后将CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切 位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上;WPRE元件根据设计的引物携 带EcoRI和Clal，通过EcoRI和Clal酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上;PolyA元件根据设计 的引物携带EcoRV和Bgin酶切位点，通过EcoRV和Bgin酶切将PolyA元件构建到pNX质粒 上，并命名为pNX-CMV中间质粒；
[0023] pNX-CMV-生长因子质粒构建:根据生长因子基因设计引物，携带Hindlll和Xhol酶 切位点，PCR扩增生长因子基因片段，Hindlll和Xhol酶切生长因子基因片段，与同样酶切处 理的pNX-CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；
[0024] 非复制性HSV-1载体构建:pNX-CMV-生长因子质粒DNA和非复制性HSV-1载体骨架 DNA使用磷酸钙共沉淀法共转染0G01细胞系，挑取阳性病毒斑;将PCR验证目的基因重组正 确的病毒斑扩大培养，使用凝胶柱纯化，超滤管超滤，获得高滴度，非复制性的HSV-1载体。 [0025] 其中，生长因子为大鼠神经生长因子，并且用GFP标记同时克隆入HSV。
[0026]其中，0G01 细胞系使用含有 10%NBS、800ug/ml新霉素和700ug/ml Zeozin的DMEM 培养。
[0027] 实施例2
[0028]实验目的及方法:为了评价本发明的可行性和有效性，本实施例通过建立大鼠外 伤性脑损伤动物模型，观察脑外伤大鼠的神经功能恢复情况，具体操作如下：
[0029] (1)建立大鼠外伤性脑损伤动物模型：
[0030]用3.6%水合氯醛（lml/100g)腹腔注射SD大鼠，麻醉后，将大鼠俯卧位固定好，常 规消毒，在距头颅前5mm处冠状切开皮肤成"U"型切口，将头皮向尾侧翻开。分离骨膜，暴露 右侧顶骨，于矢状缝旁开2.5mm，冠状缝后1.5mm钻一骨孔，咬除颅骨至骨窗扩大为直径 5.0mm X 5.0mm，显露硬脑膜，以60g重的铁质圆柱体自10cm高处沿铁杆自由落体撞击，造成 右侧大脑运动皮质区挫裂伤。
[0031] (2)细胞培养与转染准备：
[0032]生长因子-GFP和单独的GFP通过试剂商提供的操作程序分别转染入培养的皮质神 经元。操作步骤如下：
[0033] A、HSV_生长因子对皮质神经元生长的影响