一种分子改造肝靶向干扰素的方法及突变的肝靶向干扰素的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种分子改造肝靶向干扰素的方法及突 变的肝靶向干扰素。
【背景技术】
[0002] 干扰素可通过多种途径发挥抗病毒和抗癌作用，但在应用时存在着用药剂量大、 疗效不够理想、毒副作用大等缺点，限制了其在临床中的广泛应用。这主要原因是由于病毒 性肝炎和肝癌的病灶主要在肝脏，治疗时干扰素在体内容易扩散降解，导致相对平均的组 织分布，未能在肝脏形成有效的药物浓度。为了达到临床效果，药物剂量常要加大几倍、几 十倍，药物剂量的加大也加重了其不良反应，又容易产生耐药性，从而影响疗效。将肝靶向 肽CSP I-plus与干扰素(IFN)相融合，利用肝靶向肽CSP I-plus的肝靶向特性，使干扰素在 肝脏富集，达到提高干扰素治疗肝脏疾病的特异性，减少用药量，降低毒副反应，具有良好 的应用开发前景。
[0003] 但IFN-CSP是以包涵体的形式存在，需经过变性、复性等复杂制备过程才能获得有 活性的蛋白，不仅工艺复杂、最终得率不高，且由于IFN-CSP分子结构中存在两对二硫键，复 性过程中容易错误折叠，蛋白质复性效率不高，终产物的活性还有待进一步提高。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的不足，提供一种分子改造肝靶向干扰素的方法，从而 获得生物学活性更强的突变的肝靶向干扰素。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种突变的肝靶向干扰素。
[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的： 一种分子改造肝靶向干扰素的方法，具体为从氨基端开始，将11位氨基酸由丝氨酸突 变成天冬酰胺、14位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、16位氨基酸由甲硫氨酸突变成异亮氨 酸、26位氨基酸由亮氨酸突变成脯氨酸、37和102位氨基酸由甘氨酸突变成谷氨酸、44位氨 基酸由甘氨酸突变成天冬氨酸、在44和45位之间插入天冬氨酸，45位氨基酸由天冬酰胺突 变成赖氨酸、51位氨基酸由谷氨酸突变成谷氨酰胺、52位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、54 位氨基酸由脯氨酸突变成丝氨酸、68位氨基酸由丝氨酸突变成苏氨酸、79位氨基酸由苏氨 酸突变成天冬氨酸、85位氨基酸由酪氨酸突变成半胱氨酸、100位氨基酸由异亮氨酸突变成 甲硫氨酸、103位氨基酸由颉氨酸突变成谷氨酸、104位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸、106 位氨基酸由苏氨酸突变成甘氨酸、112位氨基酸由赖氨酸突变成天冬酰胺、113位氨基酸由 谷氨酸突变成丙氨酸、120位氨基酸由精氨酸突变成赖氨酸、124位氨基酸由谷氨酰胺突变 成精氨酸、131位氨基酸由赖氨酸突变成苏氨酸、151位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸、 160和163位氨基酸由丝氨酸突变成精氨酸。
[0007] 一种突变的肝靶向干扰素，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，原始肝靶向干扰素 的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 一种突变的肝靶向干扰素的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或4所示。SEQ ID NO:3为突变的肝靶向干扰素的编码基因密码子未优化前的序列，SEQ ID NO:4为突变的 肝靶向干扰素的编码基因经大肠杆菌密码子优化后的序列。
[0009] 优选地，本发明进一步保护含有SEQ ID N0:3或4所述编码基因的重组载体。更优 选地，所述重组载体的构建方法为在目的载体如PMD19-T载体或表达载体pET21b的多克隆 位点插入SEQ ID N0:3或4所述编码基因。
[0010]另外，本发明还进一步保护SEQ ID N0:2所述突变的肝靶向干扰素在制备抗病毒 和抗癌药物中的应用。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明重组突变肝靶向干扰素的活性为1 X 1〇9 IU/mg，显著高于原始肝靶向干扰素的 活性（1.2 X 108 IU/mg)。重组突变肝靶向干扰素每4000万IU中的内毒素含量小于0.25EU， 远低于中国药典中规定的每300万IU应小于10EU。而且，重组突变肝靶向干扰素的活性明显 强于普通重组突变干扰素。
【附图说明】
[0012] 图1为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素氨基酸序列比对结果。
[0013]图2为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的结构比对。
[0014] 图3为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的稳定性分析。
[0015] 图4突变肝靶向干扰素核苷酸序列大肠杆菌稀有密码子分析结果。
[0016] 图5突变肝靶向干扰素核苷酸序列密码子优化结果。
[0017] 图6突变肝靶向干扰素融合基因构建方法。
[0018] 图7为突变肝靶向干扰素融合基因的重组，其中，Μ为DNA分子量标准，1~8为第一 次S0E-PCR扩增产物，9~12为第二次S0E-PCR扩增产物，13为重组的突变肝靶向干扰素全长 基因。
[0019] 图8为重组克隆质粒的菌落PCR和双酶切鉴定，其中，Μ为DNA分子量标准，1为重组 质粒的PCR鉴定;2为Nde I、Xhol I双酶切重组质粒。
[0020] 图9为突变肝靶向干扰素基因原核表达质粒构建示意图。
[00211图10为重组原核表达质粒的菌落PCR和双酶切鉴定，其中，Μ为DNA分子量标准，1为 重组质粒的PCR鉴定;2为Nde I、Xhol I双酶切重组质粒。
[0022]图11为目的蛋白表达定位比较，A为原始肝靶向干扰素，B为突变肝靶向干扰素未 优化表达条件，C为突变肝靶向干扰素优化表达条件，其中，Μ为蛋白质分子质量标准;0代表 重组菌诱导前全菌蛋白；1代表重组菌诱导后全菌蛋白；2代表诱导后重组菌超声破菌后上 清;3代表诱导后重组菌超声破菌后沉淀。
[0023]图12为突变肝靶向干扰素纯化结果的SDS-PAGE分析，其中Μ为蛋白质分子质量标 准；1代表诱导后重组菌超声破菌后上清；2代表纯化柱穿透液;3代表50 mM咪唑的roS纯化 洗脱液;4代表100 mM咪唑的PBS纯化洗脱液;5代表500mM咪唑的PBS纯化洗脱液。
[0024]图13为HPLC检测重组突变肝靶向干扰素纯度的结果。
[0025]图14 MTT检测结果显示重组突变肝靶向干扰素具有显著抗肿瘤细胞增殖活性。 [0026]图15体内肝组织分布实验结果显示重组突变肝靶向干扰素具有肝靶向性。
[0027]图16体内抗HBV实验结果显示重组突变肝靶向干扰素作用后，HBV转基因小鼠血 清HBsAg水平显著降低。
[0028]图17体内抗HBV实验结果显示重组突变肝靶向干扰素作用后，HBV转基因小鼠肝 脏HBsAg蛋白表达水平显著降低。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0030] 实施例1 利用替换及插入的方法对原始肝靶向干扰素氨基酸序列进行分子改造(见图1)，具体 改造方法为:从氨基端开始，将11位氨基酸由丝氨酸突变成天冬酰胺、14位氨基酸由苏氨酸 突变成丙氨酸、16位氨基酸由甲硫氨酸突变成异亮氨酸、26位氨基酸由亮氨酸突变成脯氨 酸、37和102位氨基酸由甘氨酸突变成谷氨酸、44位氨基酸由甘氨酸突变成天冬氨酸、在44 和45位之间插入天冬氨酸，45位氨基酸由天冬酰胺突变成赖氨酸、51位氨基酸由谷氨酸突 变成谷氨酰胺、52位氨基