一种海洋真菌哈茨木霉dlen2008005的发酵提取物及其制备方法和应用
【专利说明】一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]随着世界人口老龄化的加剧和老年痴呆(Alzheimer’s Disease, AD)发病率的不断增加，寻找抗老年痴呆的新药已迫在眉睫。
[0003]目前，被广泛接受的老年痴呆病理理论是胆碱能神经损伤假说。在该理论的指导下，乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂是目前应用最广的抗老年痴呆症药物。同时不少研究发现，需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基会对脑组织造成损害，促进脑细胞的衰老和死亡，而且自由基还能损害细胞染色体，使第21号染色体畸变，从而发生AD。而抗氧化剂不仅能够稳定细胞膜，消除活性氧，同时还能抑制和清除脑内β淀粉样蛋白沉积，从而来预防和保护神经细胞免受损伤，从而延缓AD的发展进程。
[0004]因为乙酰胆碱酯酶抑制剂和抗氧化剂均有治疗或延缓AD的作用，因此筛选具有抑制AChE活性和抗氧化双重功能的药物具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有老年痴呆治疗药物的不足，提供一种海洋真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)DLEN2008005的发酵液活性提取物及其制备方法和应用，该菌株发酵液的活性提取物具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。
[0006]本发明的目的是提供一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。
[0007]本发明另一目的是提供上述发酵提取物及其制备方法和应用。
[0008]本发明的再一目的是提供海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质及其提取纯化方法和应用。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，是由海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液经过提取得到，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年I月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.12105;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0010]该菌株通过静置发酵后，将其发酵液的乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的总粗提物，该提取物经硅胶柱层析及制备液相色谱分离，得到两个有效部分的组分I和组分2，具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的显著活性，有作为抗老年痴呆药物的潜在用途。
[0011 ] 所述海洋真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)DLEN2008005是从中国大连海域的潮间带海藻龙须菜藻体组织内分离获得，具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶作用，依据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)鉴定为Trichoderma harzianum菌株。
[0012]该菌株的ITS1-5.8S-1TS2rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]该菌株具有下述性质:接种到海水马铃薯蔗糖培养基(海水PSA)平板上，28°(:培养，菌落开始为白絮状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状;显微镜下菌丝纤细无色，具分隔，多分枝;分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2?3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，孢壁具小统突，蓝绿色；最佳生长温度范围26?30 0C，最佳生长pH为6.0?7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源;该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。
[0014]该菌株的生长盐浓度范围为2.0%?5.0%。
[0015]另外，在上述制备发酵提取物的工艺中，具体地，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下:将海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接种于灭菌的液体培养基中，自然光照28 °C培养21?24天；
其中，所述液体培养基的制备方法为:每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然PH值;所述马铃薯煮汁为:取新鲜马铃薯去皮切成Icm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
[0016]更具体优选地，上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下:
(1)种子培养:将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28 0C下倒置培养，培养时间为4?5天；
(2)扩大培养:将IL液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121°C、0.1 Mpa灭菌20min;冷却后按照每100mL液体培养基接种上述步骤(I)培养后的种子平板带菌培养基块40?SOcm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21?24天，得到发酵液；
其中，所用到的培养基如下:
种子固体培养基为:每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；
液体培养基为:每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；
其中，马铃薯煮汁:取新鲜马铃薯去皮切成Icm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
[0017]另外，在上述制备发酵提取物的工艺中，所述提取的方法如下:
(I)提取:培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物;滤饼用200mL甲醇浸泡12?24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物;如此重复2次；
将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45°C减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45°C减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物，即得到所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。
[0018]上述发酵提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用，都在本发明的保护范围之内。
[0019]一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质(组分1)，是由上述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为:将发酵提取物溶于少量(优选5?20mL)甲醇，加入到与其干重相等的100?200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20?50倍样品干重的200?300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿:丙酮=25:1?O:1(v/v)，采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分;将有活性组分的组份样品采用反相液相色谱的方法进行进一步纯化得到;反相液相色谱的条件为:色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15μηι，尺寸为20.0 mmX250 mm，流动相为甲醇:水=8:2，流速为2 mL/min，峰的保留时间在4?9 min。
[0020]一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质(组分2)，是由上述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为:将发酵提取物溶于少量(优选5?20mL)甲醇，加入到与其干重相等的100?200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20?50倍样品干重的200?300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿:丙酮=25:1?O:1(v/v)，采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分;将有活性组分的组份样品采用正相液相色谱的方法进行进一步纯化得到;正相液相色谱的条件为:SepaFlash ?标准型快速分离娃胶柱-12 g，粒径40?63 μπι，尺寸为17 mmX85 mm，氯仿:甲醇=5:1，流速为4 mL/min,峰的保留时间在10?15 min。
[0021]而且，上述发酵活性物质(组分I和组分2)在制备抗老年痴呆药物方面的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。
[0022]本发明经