以MIC-1 cDNA为模板制备RNA探针的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸诊断领域，具体设及一种WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 巧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization ,FISH)是一种重要的 非放射性原位杂交技术，巧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的祀DNA或RNA分子杂 交，如果被检测的染色体祀DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性， 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可W直接与染色体进行 杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在巧光显微镜下观察巧光信号，W确定与特 异探针杂交后结合了巧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待 测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
[0003] 巧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高； FISH的实验周期短，探针稳定性强;通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏 度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交;FI甜的分辨率高达3-20Mb; FI甜可W用不同修饰核 巧酸分子标记不同的探针，即可W制备成多色探针。
[0004] FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动 物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于 乳腺癌、膀脫癌、肺癌、淋己瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几 个方面。CRNA探针比CDNA探针有更多的优势:避免了双链CDNA探针在杂交反应中两条链之 间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性;CRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂 交体更稳定;且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶 处理，W除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。
[0005] 制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输相关试 剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质 探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广 阔的市场前景。
[0006] MIC-I(Macro地age inhibitoiT (^ytokine-I即巨隧细胞抑制细胞因子-1)是于 1997年由克隆活化的巨隧细胞而发现的TGF-B超家族的新成员，被命名为MIC-I。人类基因 组MIC-I基因包括2个外显子(309bp和89化P)和1个内含子（1820bp)基因定位于19pl3.1。 MIC-I蛋白编码308个氨基酸，其中包括29个氨基酸的信号引导肤（signal leader peptide)、167个氨基酸的前肤（propeptide)和112个氨基酸的成熟MIC-I蛋白（matin peptide)
[0007] MIC-I的主要功能和生物特征目前尚未完全明了，其在胎盘中大量表达，提示其可 能与哺乳动物胎儿的发育有关;许多研究表明MIC-I的诱导产生与细胞周期停滞及细胞调 亡有关;其可能是巨隧细胞活性的自分泌调节物，促进肿瘤转移和增加肿瘤细胞的侵袭性。
[000引胎盘是唯一大量表达MIC-I的正常组织，前列腺、消化道及神经系统的上皮组织有 少量MIC-I mRNA的表达;最近的研究表明在许多病理状态下，如炎症和肿瘤发生时，MIC-I 的蛋白表达及血清水平会异常增高，提示MIC-I是参与多种应激反应的主要分泌因子并与 恶性肿瘤的发生发展有关。
[0009] 研究表明许多恶性肿瘤的细胞株（如膜腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌）大量表达 MIC-1，其在多种肿瘤组织中表达水平明显高于良性病变及正常组织。巧光原位杂交技术具 有快速、准确和特异性强的特点，因此，研发和生产用于诊断和监测MIC-I mRNA水平的巧光 原位杂交探针及试剂盒，具有很大的社会效益和广阔的市场前景。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种利用MIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法。
[001。 本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法包括W下步骤:A.针对 MIC-I mRNA序列筛选多个祀序列，对于每个祀序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增 产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有祀序列;B.从MIC-I CDNA质粒中，采用步 骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板;C.加入RNA聚 合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP渗入产物，纯化后得到RNA探针。
[0012] 根据本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，引物的5 '端加上T7启动子序列。
[0013] 根据本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上SP6启动子序列。
[0014] 根据本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上T3启动子序列。
[0015] 根据本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 RNA聚合酶是化C RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上化C启动子序列。
[0016] T7启动子序列：
[0017] SP6启动子序列 [001引 T3启动子序列：
[0019] Trc启动子序列
[0020] 上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可W替换使用。
[0021] 根据本发明所述的WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 步骤A中，所述筛选包括:筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要 可选择同源区域序列，作为祀序列。
[0022] 本发明还提供了一种快速检测肿瘤相关的MIC-I表达的试剂盒。
[0023] 本发明所述的试剂盒包括根据本发明所述的方法所制备的RNA探针。
[0024] 本发明所述的方法只用一步反应即可制备200-500nt理想长度的CRNA探针，并且 可直接用于下一步的杂交试验，可W提高试验效率，节约检测时间。
[0025] 本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码RNA及非特 异性信号的影响。
[0026] 本发明所述的方法制备的探针，其用途是生产在受试者样本中区分相关疾病样本 和正常样本的试剂盒。
[0027] 本发明还提供了用于在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒。
[0028] 本发明所述的用于在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒，包 括：（a)适合于检测相关疾病的检测试剂；W及(b)适合于测定由所述检测试剂检测的相关 疾病的定量的设备;其中，所述的相关疾病是用本方法制备的特异性探针检测的对应特定 疾病。
[0029] 本发明首次用多重DNA片段作为模板，针对MIC-I CDNA序列设计多对引物，并在反 向引物5'端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，W使最终得到的RNA探针能够全部覆盖所有 祀序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，更重要的 是，探针特异性和稳定性更强，降低背景信号，灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了多种 肿瘤初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。
[0030] 传统的探针标记方法直接WcDNA作为标记模板。制备检测mRNA的探针时，一般是 应用全长CDNA克隆质粒或PCR产物作为模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制备RNA或DNA探 针。但是，大部分基因 CDNA在1000 bpW上，如直接进行杂交反应会因探针长度太长而不利于 进入细胞和杂交，且会产生非特异性背景信号。制备的RNA或DNA探针一般需碱裂解或DNA酶 处理，使探针裂解成1000 bpW下的片段。然而，RNA碱裂解或DNA酶处理过程和程度不易控 审IJ，因此探针质量难W保证。
[0031] 本发明所述的方法的优势在于:采用包含所述目的序列的多条DNA片段通过一步 反应即可制备IOO-SOOnt理想长度的RNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验。探针制 备过程不需要碱裂解等步骤，就可得到长度均一性好的探针，为杂交试验理想长度的片段， 因此增强探针特异性，降低背景信号干扰，并节约大量实验时间，提高了试验效率。
[0032] 现有的RNA探针标记的方法都很难有效地将标记好的探针长度控制在运范围内。 因此，现有技术必须借助碱裂解(RNA探针)去降解标记好的探针W达到上述理想长度。