作为生物标记物的miRNA-124的制作方法
【专利说明】作为生物标巧物的m i RNA-124
[0001 ]本发明设及特别是与病毒感染结合的生物标记物领域。
[0002] 更具体而言，本发明设及用作病毒感染的诊断标记物的新型生物标记物。更具体 而言考虑的病毒感染是需要RNA剪接的病毒感染，且特别是逆转录病毒感染例如HIV和AID 相关状况。本发明还设及关于所述感染且特别是HIV和AIDS相关状况的治疗的随访标记物。
[0003] 在高等真核生物中，信使RNA不W其功能形式直接转录，而是作为前信使RNA转录， 所述前信使RNA必须经历许多加工事件，W便可由细胞翻译机制阅读。剪接是允许消除不需 要的序列（内含子），并连接有意义的序列（外显子）的过程。高度协调的剪接事件在称为剪 接体的大复合物中发生。该功能大复合物(megacomplex)是蛋白质和RNA的精屯、装配，其需 要鉴定外显子-内含子边界。外显子规律地可变剪接，意指它们或包括在最终成熟mRNA转录 物中或从最终成熟mRNA转录物中排除。近期的广泛测序研究观察到:超过90%的基因经历 可变剪接。可变剪接的mRNA的产生被反式作用蛋白质系统调节，所述反式作用蛋白质与前 mRNA自身上的顺式作用位点结合。此类蛋白质包括促进特定剪接位点的使用的剪接激活 物，和降低特定位点的使用的剪接阻遏物，分别结合在剪接增强子位点上（内含子剪接增强 子，ISE和外显子剪接增强子，ESE)和剪接沉默子位点上（内含子剪接沉默子，ISS和外显子 剪接沉默子，ISS )。
[0004] 特别是来自逆转录病毒科的病毒是全世界疾病的主因之一。可W在逆转录病毒科 中区分出=个亚科:肿瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
[0005] 因为肿瘤病毒可W与癌症和恶性感染相关，所W它们被运样命名。可W提及例如 致白血病病毒（例如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MULV)也称为莫洛尼病毒、猫白血 病病毒(FELV)、人白血病病毒例如HTLV巧肌TLV2、猿猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或 BLV、灵长类动物D型肿瘤病毒、其为乳腺肿瘤的诱导剂的B型肿瘤病毒、或引起快速癌症的 肿瘤病毒(例如劳斯肉瘤病毒或RSV)。
[0006] 泡沫病毒对于给定细胞类型或给定物种表现相当低的特异性，并且它们有时与免 疫抑制现象相关;运是例如对于猿猴泡沫病毒(或SFV)的情况。
[0007] 因为慢病毒例如HIV负责缓慢进展的病理状况，所W它们被运样命名，所述病理状 况非常频繁地设及免疫抑制现象，包括AIDS。
[000引已知病毒且特别是逆转录病毒例如HIV依赖RNA剪接和剪接调节，W便在受感染个 体的细胞和组织内传播和散布。
[0009]近来，已利用HIV是需要RNA剪接W表达关键病毒蛋白质的逆转录病毒的运一事实 来开发基于剪接抑制的新型策略，W对抗病毒感染且特别是AIDS(W0 2010/143169)。事实 上，HIV-I基因组表达9化的初级转录物，其不仅充当子代病毒的基因组RNA，还生成40种不 同的hiRNAdHIV-I使用四个多重可变5'剪接位点和八个多重可变3'剪接位点，W生成剪接的 mRNA种类。运些剪接的mRNA可W分成两类:多重剪接的（2化)和单一剪接的（地WRNAdHIV-I 可变剪接的调节主要由于亚最佳剪接位点的存在而发生，所述亚最佳剪接位点减少通过剪 接信号的细胞剪接机制的识别。在病毒剪接位点处的剪接进一步通过ESE、ESS和ISS的存在 得到调节。
[0010] 在运个背景下，已开发了哇嘟衍生物，特别是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇 嘟-2-胺，其已显示在nM浓度范围下抑制HIV-I和HIV-2T细胞向性实验室株的外周血单核细 胞(PBMC)W及不同亚型的临床分离物中的复制(WO 2010/143169)。
[0011] 微小RNA(miRNA)，最广泛的非编码组，是一类约22nt非编码RNA，其通过与祀mRNA 转录物的非编码区化TR)结合来抑制基因表达化ai等人，化ture Genetics,第30卷，no.4， 第363-364页，2002;Badel等人，Cell,第 136卷，no.2,第215-233页，2009) emiRNA基因代表 约1-2%的已知真核生物基因组。预测提出每种miRNA可W祀向超过200种转录物，并且单一 mRNA可W通过多重miRNA得到调节（LIND0W，DNA Cell Biol.,第26卷（5)，第339-351 页， 2007) DiniRNA由内源发夹形转录物生成且通过与祀mRNA的碱基配对而起作用，运导致mRNA 切割或翻译阻遏，取决于碱基配对的程度。两个加工事件导致成熟的miRNA形成:首先，将初 生miRNA转录物(pri-miRNA)加工成70个核巧酸的前体(pre-miRNA)，其从核中输出且在细 胞质中被切割，W生成短的（长约22个核巧酸）成熟miRNA化邸，EMBO J.，第21卷，第4663-4670页，2002) DiniRNA可W位于基因间或基因内。当基因间时，它们的表达与其他miRNA作为 簇进行协调(Altuvia等人，Nucleic Acids Research,第33卷，no.8,第2697-2706页，2005， OzsoIak等人，Genes and Development，第22卷，no . 22,第3172-3183页，2008)。当基因内 时，即置于蛋白质编码基因内（几乎唯一地在内含子内），它们通常从与它们的宿主基因相 同的链化 iu 等人，Cell Research,第 18 卷，no. 10,第 985-996 页，2008 ,Kim 等人，EMBO 化 urnal，第26 卷，no. 3,第775-783 页，2007)且 W相关联水平(Baskerville等人，RNA，第11 卷，no. 3,第 241-247 页，2005)表达。
[0012] miRNA近期已设及病毒感染中的宿主和病原体的复杂串扰，并且被认为在病毒发 病机理中起主要作用(NAIR，Trends in Microbiol.，第14卷，第169-175页，2006)。事实上， 病毒是使用细胞机制用于其存活和复制的专性细胞内寄生物，因此运种依赖性使得它们对 宿主基因调节机制敏感。细胞miRNA可W参与抗病毒防御机制，但在一些情况下，还可W是 病毒正调节物。另一方面，病毒自身也可W产生miRNAW调节细胞过程或病毒基因。设及 HIV-I感染的miRNA可W根据其生物发生起源定义为HIV-I编码的或宿主编码的；它们还可 W根据其功能定义为感染的阻遏物或激活物。它们可W进一步根据它们是直接祀向HIV-I 转录物还是间接影响HIV-I进行分类，通过祀向设及病毒生命周期的宿主因子，或祀向HIV-IRNA基因组和HIV-I感染必需的宿主因子两者。几个数据证明HIV-I感染由于miRNA生物发 生干扰而总体影响miRNA途径，W及通过miRNA表达概况修饰而个别影响miRNA途径巧ouzet 等人，Biochim Bio地ys Acta.2011 Nov-Dec; 1809(11-12) :686-693))。此外，宿主miRNA 已描述为调节HIV-I。
[0013] 给定药物或疫苗成功开发的一个关键因素是有效和快速评价其功效的可能性。事 实上，给定药物或疫苗在其治疗窗内进行施用是重要的，W便避免不需要的来自太高剂量 的效应，或避免由于太低剂量的功效缺乏。另外，必须确保将适当药物或疫苗施用于适当患 者，并且该患者事实上响应药物或疫苗。因此，仅仅将给定患者和给定药物或疫苗联系在一 起不一定足W获得有利的疗效。因此关键是有适当的工具，例如特异性生物标记物W依靠， 用于评价药物或疫苗的功效。
[0014] 因此，存在对新型和灵敏的工具的需要，所述工具用于评价病毒感染，并且特别是 逆转录病毒感染，并且更特别是HIV(人免疫缺陷病毒)感染，W及此类状况的治疗功效。
[0015] 存在对新型生物标记物的需要，所述生物标记物用于评价对病毒感染，并且特别 是逆转录病毒感染，并且更特别是HIV感染的治疗功效。
[0016] 存在对用于评价哇嘟衍生物功效的新型和灵敏的工具的需要，所述哇嘟衍生物是 病毒特别是逆转录病毒例如HIV，并且更特别是HIV-I和HIV-2的抑制剂。
[0017] 存在对用于评价患者对哇嘟衍生物的应答性的新型生物标记物的需要，所述哇嘟 衍生物用于预防或治疗病毒感染，并且特别是逆转录病毒感染，并且更特别是HIV感染。
[0018] 存在对用于评价哇嘟衍生物的治疗功效的新型生物标记物的需要，所述哇嘟衍生 物用于预防或治疗病毒感染，并且特别是逆转录病毒感染，并且更特别是HIV感染。
[0019] 还存在对用于筛选药物候选物或疫苗的新型生物标记物的需要，所述药物候选物 或疫苗有效预防和/或治疗病毒感染，并且特别是逆转录病毒感染，并且更特别是HIV感染。
[0020] 本发明有意满足运些需要。
[0021] 根据其目的之一，本发明设及至少一种miRNA作为病毒感染或所述病毒感染的治 疗性处理功效的生物标记物的用途，所述至少一种miRNA是miR-124。
[0022] 出乎意料的是，如下文实施例中详述的，本发明人已观察到:在由HIV毒株特别是 ADA-M R5 HIV毒株感染的PBMC中，miR-124的表达水平相对于未受感染的PBMC是减少的。
[0023] 更重要的是，本发明人已出乎意料地观察到：用哇嘟衍生物例如式(I)或（II)的哇 嘟衍生物，且特别是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇嘟-2-胺处理外周血单核细胞 (PBMC)，所述PBMC由HIV毒株特别是ADA-M R5 HIV感染，导致病毒的去除和miR-124表达的 急剧增加(相对于对照13倍）。哇嘟衍生物可W在WO 2010/143169中所述的化合物中选择且 如下文进一步描述。相应地，所述病毒感染的治疗性处理可W是用哇嘟衍生物的处理。
[0024] 相应地，miR-124自身展现为有力工具，换言之展现为生物标记物，用于监控患如 下感染的个体内的病毒感染，特别是逆转录病毒感染例如HIV感染，W及用于监控由病毒特 别逆转录病毒感染例如由HIV感染的个体，并且用于监控用抗病毒药物治疗的此类个体，所 述抗病毒药物特别是如下详述的式(I)或（II)的哇嘟衍生物，并且特别是8-氯-N-[4-(S氣 甲氧基)苯基]哇嘟-2-胺。
[0025] 因此，通过提供确认患者接受适当药物或疫苗治疗的工具，即就剂量和时间而言， 通过监控miR-124的表达水平，能够跟踪人研究试验或对人研究实验执行质量控制，或者监 控对药物方案或疫苗的患者顺应性。miR-124生物标记物还可W用于优化给药方案。因此， miR-124生物标记物可W与例如患者治疗的管理、临床试验和基于细胞的研究结合使用。
[0026] 根据其另一个目的，本发明设及至少一种miRNA作为病毒感染的生物标记物的用 途，所述至少一种miRNA是miR-124，所述病毒优选逆转录病毒，并且更优选人免疫缺陷病毒 巧 IV)。
[0027] 根据其另一个目的，本发明设及至少一种miRNA作为用于筛选药物候选物或疫苗 候选物的生物标记物的用途，所述至少一种miRNA是miR-124,所述药物候选物或疫苗候选 物推测有效预防和/或治疗病毒感染，特别是逆转录病毒感染，并且更特别是HIV感染。 [00%]根据其另一个目的，本发明设及至少一种miRNA作为用于评价候选化合物改变细 胞或蛋白质的生理活性的生物效应，特别是药理学潜力的生物标记物的用途，所述至少一 种miRNA是miRNA-124。
[0029]在运方面，本文已显示miR-124的表达水平在多种化合物的施用后改变，已知所述 多种化合物具有药理活性。因此，本发明人已显示miR-124构成了候选化合物的潜在药理活 性的有关生物标记物。
[0030] 特别地，推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候选物可W是哇 嘟衍生物。
[0031] 特别地，推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候选物可W是式 (I)的哇嘟衍生物或其药学可接受的盐之一：
[0033] 其中
[0034] -n是1或2并且R独立地代表氨原子、面素原子或选自下述的基团：（C广C3)烷基；-Mi化基团，其中化和R2独立地是氨原子或(C1-C3)烷基；（C1-C3)氣烷氧基;-N02基团；苯氧基； 和(C1-C4)烷氧基，
[00对 -R'是氨原子、面素原子或选自（C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基的基团，
[0036] -R"是氨原子或（打-C4)烷基。
[0037] 推测有效预防和/或治疗病毒感染的药物候选物或疫苗候选