一种贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的一种 具有肝脏保护作用的贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物小豆蔻为多年生草本。根茎粗壮，棕红色。叶两列，叶片狭长披针状，叶鞘具棕 黄色柔毛。穗状花序由茎基部抽出。花序显著伸长，花排列稀疏，花冠白色。果实长卵圆形， 果皮质韧，不易开裂。种子团分3瓣，每瓣种子5~9枚，种子气味芳香而峻烈。主产越南、斯里 兰卡和印度南部的马拉巴(Malabar)海岸。实成熟时收采，除去残留的果柄，晒干。使用部分 为姜科植物小豆蔻的干燥果实。
[0003] 药材小豆蔻为姜科植物小豆蔻Elettaria cardamomum(L. )Maton的干燥近成熟果 实，是藏医与维吾尔医用药，以"加素"之名始载于《四部医典》，现被多国药典收载。小豆蔻 是世界著名的植物药与香料，被称为"香料之后"，原产于印度南部、斯里兰卡及瓜地马拉等 地，在印度传统医学中使用历史超过两千年，具有祛风、健胃的功效。目前中医很少使用，小 豆蔻曾以"豆蔻"之名收载于1953年版中国药典。
[0004] 小豆蔻已报道的成分主要为挥发油，以及多糖与蛋白质，推测还含有黄酮类化合 物，但目前尚未见黄酮类成分单体的分离与鉴定。挥发油是小豆蔻中重要的活性成分，含量 高达7%，超声提取得到的挥发油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯 为主，与超临界C0 2提取所得成分类似;如以正己烷提取，挥发油组分有所不同，为柠檬烯、 桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，还含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香桧烯 等。
[0005] 小豆蔻药理活性多样，尤以抗肿瘤活性报道最多，涉及皮肤、肺、结肠等多个部位 的肿瘤，对胃肠道也有较好的保护作用，此外，还具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的贝壳杉烷类二 萜化合物，该贝壳杉烷类二萜化合物具有肝脏保护作用;本发明的另一个发明目的在于提 供上述贝壳杉烷类二萜化合物的制备方法。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] -种贝壳杉烷类二萜化合物，它具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]
[0010] -种上述贝壳杉烷类二萜化合物的制备方法，包含以下操作步骤：
[0011] (a)小豆蔻的干燥成熟果实粉碎，用80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无 醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯 萃取物和正丁醇萃取物；
[0012] (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用15%乙醇和75%乙醇洗 脱，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏;所述大孔树脂为AB-8型大孔吸 附树脂；
[0013] (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、 30:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组分；
[0014] (d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0015] (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (1)〇
[0016] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。实验表 明，上述贝壳杉烷类二萜化合物化合物（I)能使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐 受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。即化合物（I)能够减轻人肝细胞缺血 再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
[0017]以化合物（I)的治疗有销量为主药作为药物组合物的形式使用时，可药用载体或 赋形剂可以是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发 明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。即本发明化合物（I)作为药物可通过口服 或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶 囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或 油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。小豆蔻购自安徽 亳州中药材市场。
[0022] 制备方法：（a)小豆蔻的干燥成熟果实(8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6LX3次）、乙酸乙酯(6LX3次)和水饱 和的正丁醇(6LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(355g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用15 %乙醇（8L)和75 % (12L)乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（136g);(c)步骤 (b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、50:1(8个柱 体积）、30:1 (6个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱 得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个 柱体积）、12:1(10个柱体积）和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2(llg)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I) (23mg)〇
[0023] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 369.1712，结合核磁特征可得分子式为 C20H26〇5，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (4 · 80，t，J = 8 · 6)， H-2(1.83，m)，H-3(1.32，d，J=13.5)，H-3(1.20，m)，H-5(2.48，br，s)，H-6(9.79，br，s)，H-9 (4.24，d，J=9.3)，H-ll(6.42,overlap)，H-12(6.39,overlap)，H-13(3.08，m)，H-14(2.09， d，J=10.8)，H-14(1.88,overlap)，H-15(5.71，s)，H-17(5.36，s)，H-17(5.05，s)，H-18 (1.01，s)，H-19(0.97，s)，H-20(4.31，d，J = 8.5)，H-20(4.25，d，J = 8.5);核磁共振碳谱数 据Sc(ppm，DMS0-d6，125Hz):77.4(CH，l-C)，24.1CH2,2-C)，37.4(CH2,3-C)，31.3(C，4-C)， 54.5(CH，5-C)，206.5(CH，6-C)，176.4(C，7-C)，51.2(C，8-C)，42.4(CH，9-C)，54.3(C，10-C)，126.9(CH，n-C)，136.2(CH，12-C)，40.3(CH，13-C)，37.1(CH2，14-C)，77.1(CH，15-C)， 155.4(C，16-C)，106.7(CH2，17-C)，33.1(CH 3，18-C)，23.5(CH3，19-C)，68.1(CH2,20-C);碳 原子标记参见图1。IR光谱结果显示，化合物（I)含有羟基、内酯羰基、醛基和双键(3427CHT 1、 1723CHT1、1740CHT1和1631 cnf1)基团。核磁数据表明，该化合物是1，8-内酯结构的结构贝壳 杉烷类二萜。4-? COSY谱中，烯烃次甲基的质子(δΗ6.42和6.39)与H-9和H-13的相关性，表 明 C-11 和 C-12 之间含有双键;HMBC 谱中 Η-11(δΗ6.42)与 C-9(SC42.4)，C-1O0C54.3#PC-13 0〇4〇.3)以及!1-9(5!14.24)，!1-130!13.〇8)和!12-14(5!12.〇9和1.88)与(：-120(：136.2)的相 关性验证了上述推测。该化合物结构如图1所示。
[0024]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0025] -、材料和仪器
[0026] HL7702肝细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。化合物（I)为自制(纯度 大于98% )。高糖DMEM培养基、高糖DMEM/F12 = 1:1培养基、胎牛血清均购于HycLoneJDTA购 于上海试剂一厂。台盼蓝购于北京化工厂。无糖DMEM培养基购于Gibco。胰酶、MTT、DMS0均购 于Amrescc^LDH释放法检测试剂盒购于GENMDEALT生化检测试剂盒、AST生化检测试剂盒、 LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克曼试剂有限公司。Western及IP细胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购于碧云天生物研究所。
[0027] C02培养箱，SheL-Lab 2300;电热恒温孵育箱，上海跃进医疗器械厂;缺氧培养盒， 长沙长锦科技有限公司；酶标仪，美国BioTek Epoch;全自动生化仪，Beckman LX20;离心 机，德国Eppendorf centrifyge 5415D。
[0028] 二、试验方法
[0029] 1、细胞分组
[0030] 将细胞分为6组，每组6个复孔：（1)正常培养组(N组）：完全培养基，正常条件下培 养；（2)缺血再灌注组（IR组）：完全培养基正常条件下培养lh后，模拟缺氧8h，再灌注4h; (3) 化合物（I)组:RE1组:化合物（I) 0.5ng/mL预处理lh; RE2组:化合物（I) 5ng/mL预处理lh; RE3 组:化合物（I)50ng/mL预处理lh;模拟缺氧8h，再灌注4h; (4)生理盐水组(NS组）：以与化合 物（I)同等体积的生理盐水预处理1 h，模拟缺氧8h，再灌注4h。
[0031] 2、化合物（I)的预处理
[0032] (1)化合物（I)的配制：将lmg化合物（I)溶解于500mL生理盐水中。移液枪吸取 2.5mL于第一支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为500ng/mL的化合物（I)溶 液。从第一支离心管中吸取lmL至第二支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为 50ng/mL的化合物（I)溶液。从第二支离心管中吸取lmL至第三支离心管中，用生理盐水稀释 至1 OmL配制成浓度为5ng/mL的化合物（I)溶液。作好标记。
[0033] (2)化合物（I)预处理：正常培养组和缺血再灌注组以每孔100yL新鲜的完全培养 基更换。RE1组每孔加入5ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE2组每孔 加入50ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE3组每孔加入500ng/mL的 化合物（I)溶液l〇yL和新鲜的完全培养基90yL。生理盐水组每孔加入生理盐水10yL和