一种醋酸亮丙瑞林的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，具体为一种利用反相高效液相色谱 法，对固相合成的亮丙瑞林粗品进行等度和梯度洗脱，并对其进行转盐的制备方法。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌在全球范围内十分常见，世界卫生组织国际癌症研究机构于2012统计， 该年全球新诊断的前列腺癌患者为110万，约占新增癌症病例总数的15%，即成为全球范围 内男性第二常见的癌症。美国癌症学会(ACS)发布的《2015年癌症统计》报告预计，2015年美 国的新发癌症病例为1658370人，其中26%的男性病例为前列腺癌，是男性好发癌症中的首 位。与欧美等发达国家相比，中国的前列腺癌发病率较低，但却在快速上升中。据统计，中国 前列腺癌的发病率在近二十年间增长了超过10倍，成为男性恶性肿瘤的第6位。中国抗癌协 会泌尿男性生殖系肿瘤专业委员会的数据显示，截止至去年年底，中国前列腺癌每年新发 病例达330万人。其中经济发达地区尤为严重，2009年的统计数据显示，城市地区的发病率 比农村地区高四倍以上，而北京、上海、广州的发病率分别为19.3/10万、32.23/10万、 17.57/10 万。
[0003] 多肽、蛋白质是生命体内一类具有特定生物活性，对机体生命活动发挥重要调节 功能的活性物质。随着生物技术和多肽合成技术的发展，这些生物活性分子也大量的可以 利用人工的方法获得，并进行鉴定、分离和纯化。醋酸亮丙瑞林是一种常用的激素类抗恶性 肿瘤药物，是促性腺素释放激素(LHRH)类似物，含有9个氨基酸的多肽，其促黄体生成激素 (LH)释放活性约为LH-RH的15倍，它的抑制垂体-性腺系统功能的作用也强于LH-RH。醋酸亮 丙瑞林是高活性的LH-RH类似物，由于它对蛋白分解酶的抵抗力和对LH-RH受体的亲和力都 比LH-RH强，所以能有效地抑制垂体-性腺系统的功能。临床上具有很大的应用价值。醋酸亮 丙瑞林从1989年批准上市以来，用于治疗子宫内膜异位症、子宫肌瘤、中枢性性早熟症、晚 期前列腺癌的效果已经得到公认。其毒副作用小，已经成为治疗晚期前列腺癌的首选药物。
[0004] 醋酸亮丙瑞林可以通过人工固相合成的方法得到，并利用反相高效液相色谱对其 进行分离纯化。高效液相色谱经过30多年的快速发展，已经取得了长足的进步，其中反相高 效液相色谱因其良好的选择性，具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点，在多肽的分 离纯化中备受青睐，其应用范围不断扩大，具有广阔前景。利用反相高效液相色谱对多肽进 行分离纯化时，反向色谱柱填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键 合相，通常使用十八烷基硅烷键合硅胶。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常以水、缓 冲液为水相，甲醇、乙腈、异丙醇等为有机相，水相和有机相组成混合试剂进行二元梯度洗 脱。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱 上有更强的保留。
[0005] 传统的转盐方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面装填阴阳离子树脂，利用离子交 换的原理实现多肽产品的转盐过程。另外利用传统阴阳离子交换原理，对多肽产品进行转 盐，步骤1)在调整多肽产品液体的PH后，上样挂柱2)冲洗样品3)利用酸碱调整冲洗液的PH 后将多肽产品冲洗下来，在此过程中，每一个环节都要取少许的流出液进行HPLC检测，确认 冲洗干净后，方可进行下一步工作。所以此方法，工作流程多，时间消耗大，而且会产生大量 的废液，更重要的是最后收集的多肽产品合格液体积大，不利于下面的浓缩和冻干工作。另 外需要购置仪器设备和阴阳离子填料，还需另外安排实验场地和人员，耗费了大量的人力 物力。
[0006] 2009年11月上海丽珠制药有限公司获得注射用醋酸亮丙瑞林微球药品批文。2011 年8月美国FDA批注了 Abbott公司每3个月注射1剂用醋酸亮丙瑞林。2012年2月杭州中肽生 化有限公司醋酸亮丙瑞林产品零缺陷通过了美国FDA现场审查，成为国内通过FDA检查的唯 一多肽制造商。国内外许多制药公司也在积极研发优化醋酸亮丙瑞林微球工艺，使其缓释 周期更长。另外国内外不乏关于亮丙瑞林的文献，但是少有利用反相高效液相色谱法对亮 丙瑞林进行粗纯、精纯、转盐方法的相关文献。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱系统对醋酸亮丙瑞林进行纯 化制备的方法。主要解决现有醋酸亮丙瑞林纯化制备方法存在生产工序复杂、周期长、成本 高、收率低转盐困难等技术问题。本发明的技术方案是:通过固相合成的方法得到亮丙瑞林 粗品，对亮丙瑞林粗品进行溶解、过滤、检测后利用反相高相液相色谱系统对其进行粗纯、 精纯、浓缩、转盐、再浓缩、过滤，最后进行冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品。本发明所述的 纯化制备方法，通过改变醋酸亮丙瑞林纯化制备的生产工艺，达到了缩短生产周期，降低纯 化制备成本，提高产品收率的目的，既适合于实验室研发，也适合于大规模的工业化生产。
[0008] 本发明的技术方案如下:一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，包括以下步骤： 1) 固相树脂Boc-Pr〇-E(E为聚苯乙烯树脂)置于反应瓶中，用无水CH2CI2搅拌洗涤，抽 干;经去保护基、洗涤、中和、洗涤、抽干，然后按照亮丙瑞林多肽序列，依次接二肽、接三肽、 直到接完九肽，得到亮丙瑞林九肽树脂pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pr〇-iE_，最 后经过裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)脱侧链保护，沉淀、过滤、析出固体，洗涤，抽干，真 空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品； 2) 亮丙瑞林粗品溶解在醋酸、乙腈、水溶液中，超声处理，经过滤膜过滤，取滤液待用； 3) 利用高效液相色谱仪，检测亮丙瑞林粗品纯度;利用质谱仪器确认亮丙瑞林粗品分 子量； 4) 对过滤后的亮丙瑞林粗品进行粗纯，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴向压 缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度100%纯化水，进行等 度洗脱分离纯化。采用紫外检测器对样品进行检测，收集目的峰值的肽溶液； 5) 对粗纯后的亮丙瑞林粗品进行分离纯化，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴 向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸 水溶液，进行梯度洗脱分离纯化。采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽 溶液； 6) 将分离纯化后的高纯度高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用； 7) 将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱采用离子交换法转成醋酸盐； 8) 将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检 测合格即为最终产品。
[0009] 步骤1)所述的CH2C12搅拌洗涤为3次，每次10分钟。
[0010] 步骤1)所述的经去保护基、洗涤、中和、洗涤：去保护基：加入9-10N HCl/iPrOH+ CH2C12，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2C12洗涤3次，抽干;DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙 胺/CH 2C12洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤:DMF洗涤1次，抽干;CH2C1 2洗涤5~6次至呈 中性。
[0011] 步骤2)所述的醋酸、乙腈、水溶液配置时，体积比为醋酸：乙腈:水=1:2:40。
[0012]步骤4)5)7)所述的制备动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的 反相硅胶，Kromasil C18 10um ΙΟΟΑο
[0013] 步骤4)中的流动相梯度选择0.0111^11到4〇1^114:8质量百分浓度为5%:95%等度洗 脱。
[0014] 步骤5)中的流动相梯度选择0.01 min到40min A:B质量百分浓度由22%:78%~28%: 72%梯度洗脱。
[0015] 步骤7)所述的反相动态轴向压缩柱转醋酸盐使用流动相为30~50mmol醋酸胺缓 冲盐体系。
[0016] 本发明的有益效果:本发明提出了一种醋酸亮丙瑞林的制备方法。本发明利用反 相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行粗纯具有下述特点:特点1:粗纯过程所使用的流动相 为常用的乙腈和水，上样后，进行等度洗脱，因为水的极性很强，可以将目标物中极性强的 杂质组分先从制备柱中冲洗出来，目标物仍保留在制备柱中，起到了分离杂质的作用。特点 2:在对目标物进行等度冲洗的过程中，水可以将目标物中含有的大量切割试剂TFA(三氟乙 酸)及其形成的强酸弱碱盐冲洗出来，大大降低了目标物中TFA根离子的含量，起到脱盐的 作用。特点3:传统的纯化过程中，有的不采用粗纯的方法，直接进行纯化分离;有的以阴阳 离子树脂载体，运用离子交换法进行粗纯，此方法在粗纯的过程中，使用大量的溶剂试剂， 增加了目标物的损耗同时会产生大量的溶剂废液，目标物溶液体积也非常大，增加了浓缩 环节的时间和工作量，降低了工作效率和产品收率。采用本发明的粗纯方法，可以大大降低 废液排放，减少目标物损耗，提尚广品收率。
[0017] 采用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行转盐，与传统的转盐方法相比，本发 明具有下述特点：特点1:本发明利用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行转盐，使用乙