产纤维素酶放线菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产纤维素酶，具体的说是产纤维素酶放线菌及应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是自然界中分布最为广泛、产量最为丰富的可再生资源，广泛存在于植物 的根茎叶中。我国是农业大国，每年秸杆产量约为7亿吨左右，秸杆中的主要成分为纤维素。 纤维素降解后可转化为生物燃料、优质饲料等物质。然而在自然界中，纤维素降解困难，主 要源于其特殊的结构。纤维素是由葡萄糖通过β_(1，4)糖苷键连接而成的线状大分子聚合 物。纤维素酶是能够将纤维素降解为葡萄糖的一类酶的总称，根据其催化功能分为三大类： 1)葡聚糖内切酶(1，4-0-D-glucan glucanohydrolase):该酶能够随机切割纤维素多糖链 内的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链末端；2)葡聚糖外切酶（l，4-i3-D-glucan cellobilhydrolase):作用于纤维素还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，产生葡萄 糖或纤维二糖;3)β_葡聚糖苷酶(β-l，4-glucosidase):该酶功能为水解纤维二糖产生葡萄 糖。由于纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双 糖或多糖，而被广泛应用于食品加工、酿造、造纸、饲料添加剂、纺织、医药等工农业领域。使 得纤维素酶成为酶制剂工业中的一个新的增长点。纤维素酶主要由微生物产生，受制于纤 维素酶制剂工业化生产的因素主要有菌种和酶活及产量，因而高酶活微生物的筛选和产酶 条件的优化尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种高效产纤维素酶放线菌及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 一种高效产纤维素酶放线菌，放线菌（Streptomyces sp. )nC24,已于2015年12月 9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC No.11848。
[0006]所述产纤维素酶放线菌分离自粉碎的苹果树枝条自然发酵腐熟的木肩中，通过纤 维素酶活的测定及菌种鉴定表明，该菌是一株产酶能力强、纤维素酶活高的放线菌菌 (Streptomyces sp.)。对该菌进行16S rRNA基因序列分析，并通过在GenBank中比对发现， 本发明的放线菌扩增的 16S rRNA序列与Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus NRRL Β-1773τ(登录号:KJ706443)相似性最高，为99%。从而将分离出来的放线菌菌命名为 Streptomyces sp.YIC24〇
[0007] 所述放线菌(Streptomyces sp. )YIC24在生产纤维素酶中的应用。
[0008] 进一步的说，将所述放线菌（Streptomyces sp. )YIC24于羧甲基纤维素钠产酶培 养基中培养获得纤维素酶。
[0009] 更进一步的说，将所述放线菌（3奸6口加1117〇6 8 8。.）￥1024在。!1 = 7、羧甲基纤维素 钠浓度为12.5g/L、NaN03浓度为5g/L的羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶。 产酶培养基中酶活最强，滤纸酶活达21.68 ±0.67IU/mL，内切酶酶活达19.37 ± 1.26IU/mL， 外切酶酶活达29.21 ±0.98IU/mL。
[0010]本发明所具有优点：
[0011] 1.本发明的放线菌YIC24具有产纤维素酶活高的特性，该菌在纤维素筛选平板上 降解圈/菌落直径达到7.0，在发酵培养基中酶活较高，滤纸酶活为16.90±0.30IU/mL，内切 酶酶活为17.65 ± 1.35IU/mL，外切酶酶活为 21.62 ± 1.26IU/mL。
[0012] 2 ·经本发明优化后，该菌产酶能力明显提高，滤纸酶活为21 · 68±0 · 67IU/mL，内切 酶酶活为19.37 ± 1.26IU/mL，外切酶酶活为 29.21 ±0.98IU/mL。
[0013] 3.本发明菌株分离自秸杆腐熟发酵的秸杆中，属于Streptomyces菌株，因而无毒 无害，未经遗传改造，可放心应用到秸杆堆肥腐熟、秸杆还田、饲料加工、纤维素酶工程领域 中。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例提供的菌株YIC24的菌落照片。
[0015] 图2为本发明实施例提供的菌株YIC24产纤维素酶的刚果红染色前照片。
[0016] 图3为本发明实施例提供的菌株YIC24产纤维素酶的刚果红染色照片。
[0017]图4为本发明实施例提供的菌株YIC24培养条件优化前后纤维素酶酶活
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0019] 实施例1:菌株YIC24的获得
[0020]从粉碎的苹果树枝条堆肥腐熟物中采集约lg腐熟物，进行梯度稀释，从ΠΓ1~10 _8,分别吸取l〇〇yL悬浊液进行涂布至羧甲基纤维素钠固体培养基，28°C倒置培养3-5天，分 别挑取单菌落至PDA培养基平板，反复划线直至纯化后转接至PDA培养基斜面(参见图1)。将 纯化后的菌株分别转接至羧甲基纤维素钠固体培养基，培养3天，测定菌落直径后，用lmg/ ml的刚果红溶液染色lh，弃去染料，加入lmol/L的NaCl溶液脱色lh，然后用去离子水冲洗3-5遍后测定透明圈直径。一般说来，比值的大小与菌株降解纤维素能力大小有关。水解圈和 菌株直径的比值越大，菌株降解纤维素的能力越强，因此比值大小的定性试验，直接反映了 菌降解纤维素的的能力。因此，本研究选取了水解圈和菌株直径的比值最大的菌株YIC24作 为研究对象。
[0021] 羧甲基纤维素钠固体培养基:羧甲基纤维素钠5g、KH2P〇4 lg、NaN〇3 3g、KCl 0.5g、 MgS〇4 0 · 5g、蒸馏水 1000ml、FeS〇4.7H200 · Olg，琼脂粉15g。（调pH在5 · 5-6 · 0，于121°C， 0· llMpa下灭菌30min备用）。
[0022] PDA培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml、1.5%琼脂。（自然pH值， 于121°C，0. llMpa下灭菌30min备用）。1)菌株鉴定
[0023] 将上述纯化获得的产纤维素酶活高的菌株进行菌落观察，在roA固体培养基上，菌 落产生白色气生菌丝，为典型放线菌的表型特征。
[0024] 分子鉴定:为了确定本实施放线菌菌株YIC24的系统进化地位，对其16S rRNA基因 序列测定与系统发育分析。
[0025] 首先提取该菌株的基因组DNA，并扩增其16S rRNA的基因序列，PCR引物为27F: (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，1492R:(AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，将PCR产物进行 测序并进行序列分析，表明，与Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus NRRL B-1773τ(登录号:KJ706443)相似性最高为99%。
[0026] Streptomyces sp.YIC24的 16S rRNA基因序列：
[0027] ACCTTCGGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGG AAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCTGCCAAGGCATCTTGGCGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCC CGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG ATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGG TACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATT ATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCG ATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGG