培养扩增高增殖力、高细胞毒活性dc-cik细胞的培养试剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种培养扩增高增殖力、高细胞毒活性DC-CIK细胞的培养试剂。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细 胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模 式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采 集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫 功能，从而达到治疗肿瘤的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细胞疗法、TIL细 胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。
[0003] 树突状细胞(Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高 效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迀移能力，成熟DC能有效激活初始型 T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能 活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量 体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机 体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。
[0004] CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新 型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时 表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋 巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
[0005] DC和CIK共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。化疗后应用 DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效 应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应 用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种培养扩增高增殖力、高细胞毒活性DC-CIK细胞的培养 试剂及培养方法，以获得高增殖力、高杀伤力的DC-CIK细胞。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] 一种DC-CIK细胞培养试剂，包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试 剂;所述DC细胞培养试剂包括DC细胞培养试剂A和DC细胞培养试剂B，DC细胞培养试剂A包含 GM-SCF和IL-4，DC细胞培养试剂B包含GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC;所述CIK细胞培养试剂包 括CIK细胞培养试剂A和CIK细胞培养试剂B，CIK细胞培养试剂A包含INF-γ，CIK细胞培养试 剂B包含0KT-3、IL-la和IL-2;所述共培养试剂包含化合物SchinlignanF和IL-2。
[0009] 进一步地，所述的DC-CIK细胞培养试剂还包括含有血浆的无血清培养基。
[0010]进一步地，所述无血清培养基中血浆的体积百分含量为5 %~15 %。
[0011] 进一步地，所述DC细胞培养试剂A中，GM-SCF的浓度为100~500U/mL，IL-4的浓度 为100~500U/mL。
[0012] 进一步地，所述DC细胞培养试剂B中，GM-SCF的浓度为100~300U/mL，IL-4的浓度 为 200 ~400U/mL，TNF-a 的浓度为 300 ~500U/mL，MDC 的浓度为 5 ~15ng/mL。
[0013] 进一步地，所述CIK细胞培养试剂A中，INF-γ的浓度为500~900U/mL。
[0014] 进一步地，所述CIK细胞培养试剂B中，0KT-3的浓度为60~100ng/mL、IL-la的浓度 为 100 ~200U/mL，IL-2 的浓度为600 ~800U/mL。
[0015] 进一步地，所述共培养试剂中，IL-2的浓度为100~500U/mL。
[0016] 进一步地，所述共培养试剂中，化合物Schinlignan F的浓度为20~40yg/mL。
[0017] 一种利用上述DC-CIK细胞培养试剂培养DC-CIK细胞的方法，包括如下步骤：
[0018] 步骤S1，将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞和悬浮细胞；
[0019] 步骤S2,采用DC细胞培养试剂A培养所述贴壁细胞，培养4~6天后，采用DC细胞培 养试剂B培养24~48h，得到DC细胞;采用CIK细胞培养试剂A培养所述悬浮细胞，培养1~3天 后，采用CIK细胞培养试剂B继续培养7~8天，继续培养过程中每隔3天补加 IL-2，获得CIK细 胞；
[0020] 步骤S3,将步骤S2中的DC细胞和CIK细胞混合，采用所述共培养试剂培养5~8天， 得到DC-CIK细胞。
[0021] 本发明的优点：
[0022]本发明提供的培养试剂可以培养出增殖力高、杀伤力强的DC-CIK细胞。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0024] 本发明化合物Schinlignan F的制备方法参见文献〖Isolation and anti-hepatitis B virus activity of dibenzocyclooctadiene lignans from the fruits of Schisandra chinensis，Phytochemistry，116(2015)，253-261〇
[0025] 实施例1: DC-CIK细胞培养
[0026] (一)单个核细胞分离
[0027] 1、外周血或脐带血40mL，500~800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56°C灭活30min 后，2000~3000g离心5min，上清血衆2~8°C备用；
[0028] 2、下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液:Ficol 1分离液为2: 1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
[0029] 3、500~700g离心15~30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
[0030](二)DC细胞分离培养
[0031] 1、获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200~400g离心5min，清洗两遍；
[0032] 2、加无血清培养基(含5 %自体血浆)重悬细胞，按2~8 X 106/mL接种T75培养瓶中 静置1~5h，获得贴壁细胞；
[0033] 3、贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5%自体血浆的无血清培养基，同时添加 因子 GM-SCF 为 300U/mL、IL-4 为 300U/mL 进行培养；
[0034] 4、三天后补加 GM-SCF为300U/mL、IL-4为300U/mL，培养至4~6天后换液，同时添加 GM-SCF 为 20U/mL、IL-4 为 30U/mL、TNF-a 为400U/mL、MDC 为 10ng/mL，培养 36h，得到目的 DC 细 胞。
[0035](三)CIK细胞培养
[0036] 1、DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一 T75培养瓶中并计数，根据计数结 果，调整细胞密度为5~15 X 105/mL进行CIK培养；
[0037] 2、第1天添加细胞因子INF-y 700U/mL，自体血浆5%;第2天添加细胞因子01〇'- 380ng/mL、IL-lal50U/mL、IL-2700U/mL;
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