一种干细胞分化培养基及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，特别涉及一种干细胞分化培养基及其应用。
【背景技术】
[0002]当前分析造血干/祖细胞分化潜能的培养基是半固体培养基(MethoCult?)，原理是造血干/祖细胞在含有增殖分化添加因子的半固体介质下增殖分化形成集落，基于这种半固体培养基的评估方法就是经典的集落形成单位实验(Colony Forming Unit Assay)。基于半固体培养基的集落形成实验分析方法只能分析一群混合细胞，优势仅仅局限于分析一个细胞群中能够形成各种造血集落的种类和数量，但是不能在单细胞水平上精确分析单个造血干/祖细胞的分化潜能。虽然半固体培养基可以局限单个细胞在形成集落时候的迀移，现实操作中无法排除一个混合型集落是单个细胞分化产生还是多个细胞因空间位置叠加在一起分化导致的混合细胞污染。此外，集落形成实验使用培养基的最小单位是3.3ml，可以分析两个细胞混合物重复样品，并且每个单位使用浪费大约1.1ml半固体培养基，浪费率达33%。基于半固体培养基的集落形成实验，还存在如下不足:半固体培养基粘稠的因素导致操作费时，不利于大规模批量化操作;在用移液器或者注射器吸取半固体培养基的时候难以精确控制培养基体积，从而在重复样品之间引入较大误差。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有造血干祖细胞分化潜能体外评估技术的缺点与不足，提供一种干细胞分化培养基。
[0004]本发明的另一目的在于提供所述干细胞分化培养基的应用。在造血干/祖细胞分化潜能体外评估技术应用上述干细胞分化培养基，能实现10?14天快速、大批量评估单个造血干祖细胞的分化潜能，精确率100%，不会出现判断误差。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种干细胞分化培养基，成分组成如下:以α-ΜΕΜ为基础培养基，按比例添加如下成分:终浓度为体积百分比10?20%的FBS(胎牛血清)、终浓度为质量体积比0.1?I %的BSA (牛血清蛋白)、终浓度为I O—4?I O—5m01 /L的2-β-mercaptoethanol (巯基乙醇)、终浓度为I?5mM的L-gln(左旋-谷氨酰胺)、终浓度为10-100ng/ml的SCF(干细胞因子)、终浓度为10_50ng/ml的IL3(白介素3)、终浓度为I?5U的EPO(促红细胞生成素)、终浓度为10?100yg/ml的维生素C、终浓度为I?20yg/ml的(± )-α-Sulfur acid(硫辛酸)。
[0006]所述的干细胞为造血干/祖细胞。
[0007]所述的干细胞分化培养基在对造血干/祖细胞分化潜能评估中的应用，特别适合应用于对单个造血干/祖细胞分化潜能进行评估。
[0008]所述的干细胞分化培养基在对造血干/祖细胞分化潜能评估中的应用，包括如下步骤:
[0009](I)将所述的干细胞分化培养基加入到细胞培养板中；
[0010](2)通过流式分选仪，采用单细胞模式分选待分析细胞，往细胞培养板中的每个孔分选入一个待分析细胞；
[0011](3)将含有单个细胞的细胞培养板转入细胞培养箱，37°C、5%⑶2条件下培养10?14天;在培养期间，隔天更换新鲜的干细胞分化培养基，更新方法为移出一半旧的培养基，添加等体积新鲜的37°C预热培养基；
[0012](4)对步骤(3)培养增殖得到的细胞进行检测，确定待分析细胞的分化潜能。
[0013]步骤(I)?(3)为在无菌条件下进行操作。
[0014]所述的细胞培养板优选为96孔细胞培养板。
[0015]步骤(4)中所述的检测的方法包括细胞甩片、细胞染色形态学分析以及流式免疫表型分析。
[0016]所述的细胞染色形态学分析为吉姆萨染色分析。
[0017]所述的流式免疫表型分析中所用到的抗体包括识别髓系巨噬细胞的抗体、识别髓系粒细胞的抗体、识别髓系红系细胞的抗体。
[0018]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0019]1、本发明提供的培养基能在单细胞水平上100%精确评估造血干祖细胞的分化潜能，避免了半固体培养基集落形成实验中一个混合集落是因为污染多个造血干祖细胞的假阳性现象。
[0020]2、本发明提供干细胞分化培养基为液态培养基，克服了传统的半固体培养基需要提前液化、因粘稠导致体积衡量不准确、吸取困难及重复样品之间因体积不准确而误差较大等缺点。
[0021]3、本发明提供的干细胞分化培养基可以在任意诱导分化时刻进行换液，便于及时更新新鲜培养基，维持细胞增殖分化的最佳条件。
[0022]4、本发明提供的干细胞分化培养基使用剂量容易控制，单个细胞培养的使用剂量可以在20-50ul/孔，结合96孔板，192孔板，384孔板，可以通过自动移液器、排枪等进行高通量分装样品操作，大大提高操作效率。
[0023]5、本发明的培养基含有增强细胞活力的添加剂，单个造血干祖细胞经10-14天增殖分化，可以获得10000?100000数量级细胞，便于收集进行甩片、细胞染色形态学分析以及流式免疫表型分析。
【附图说明】
[0024]图1是单个造血祖/干细胞在实施例1提供的干细胞分化培养基中增殖分化14天的显微镜(1X)照片图。
[0025]图2是单个造血祖/干细胞在实施例1的培养基配方中增殖14天后的吉姆萨染色分析的照片(40X )图；其中，箭头表示髓系粒细胞，方框表示髓系单核细胞。
[0026]图3是单个造血祖/干细胞在实施例1提供的培养基中增殖14天后的流式免疫表型分析结果图；其中，图(A)表明增殖分化的细胞含有髓系(Mac 1+，Gr 1+)细胞，图(B)表明增殖分化的细胞含有红系(TER119+)细胞。
[0027]图4是单个造血祖/干细胞在实施例2的培养基配方中增殖14天后的吉姆萨染色分析的照片(40X )图；其中，Ery代表红细胞，Mac代表巨噬细胞，Gran代表粒细胞。
[0028]图5是细胞免疫表型的流式分析鉴定图；其中，I是实施例3增殖获得的细胞;2是外周血单核细胞，作为对照分析；图(A)为识别髓系细胞表面分子的CDllb抗体染色流式分析图，图(B)为识别髓系粒细胞表面分子Grl的抗体染色流式分析图。
[0029]图6是造血祖/干细胞分别在实施例3和对比例I提供的干细胞分化培养基培养下的增殖分化结果图；图(A)为对比例I提供的干细胞分化培养基，图(B)为实施例3提供的干细胞分化培养基。
[0030]图7是造血祖/干细胞分别在实施例3和对比例I提供的干细胞分化培养基培养下的增殖产率统计结果图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033]—种干细胞分化培养基的精确配方如下:整个过程无菌条件下，以商业化的α-ΜΕΜ为基础培养基，按比例添加如下成分:10%FBS(胎牛血清)、0.1%BSA(牛血清蛋白)、1X10—5M 2-0_mercaptoethanol (巯基乙醇)、lmM L-gln(左旋-谷氨酰胺)、10ng/ml SCF(干细胞因子)、10ng/ml IL3(白介素3)、IU EPO(促红细胞生成素)、10yg/ml维生素C、lyg/ml ( ± )-α-Sulfur acid(硫辛酸)。
[0034]使用方法:
[0035](I)无菌条件下利用自动加样系统或者排枪，以50μ1/孔的体积将本实施例的培养基转入96孔板。
[0036](2)无菌条件下借助流式分选仪，采用单细胞模式分选待分析细胞，每个孔分选入一个造血干/祖细胞。
[0037](3)无菌条件下将含有单个细胞的96孔板转入细胞培养箱，37°C、5%C02条件下培养14天。
[0038](4)步骤(3)培养期间，隔天更新新鲜的干细胞分化培养基，更新方法为移出一半旧培养基，添加等体