下调木质素的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域:本发明涉及一个降低木质素合成的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白，属 于分子生物学中的基因技术领域。
【背景技术】：
[0002] 木质素为芳香族聚合物，是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质， 主要存在于次生加厚的植物细胞壁中，可为植物提供机械支持，保护植物免受真菌入侵，近 几十年的研究己阐明了木质素单体的主要生物合成路线，并且通过木质素调控能够提高木 本植物的制浆率和草料的可消化性等。同时，植物也能适应三种木质素单体(H/G/S)间较大 的比例变化。参与木质素生物合成途径的酶有十多种，其中咖啡酞辅酶A-3-0-甲基转移酶 (CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的一种关键酶，主要催化羟基辅酶A酯的甲基化反应， 将咖啡酰辅酶A转化成阿魏酰辅酶A。该基因与G型木质素和S型木质素合成密切相关。相关 文献报道，抑制CCoAOMT表达会使植物中木质素含量普遍降低，且伴随组分的改变，G和S木 质素同时降低，G木质素的下降幅度大于S木质素，S/G比值增加，最终使植物中木质素含量 降低，木材结构疏松，有利于工农业生产应用。CCoAOMT近来才被证实与木质化有关。 Pakusch等首先提出可能存在一种催化咖啡酰CoA( coenzyme A)甲基化的甲基转移酶； Kuhnl等与Pakusch等在欧芹和胡萝卜的细胞培养液中发现了该酶活性，由于其活性受真菌 激活子诱导，起初认为与植物抗病有关。Schmi tt等从欧芹中克隆了 CCoAOMT的cDNA，但并未 确定其功能。Ye等在百日草中首次证实CCoAOMT参与木质素的生物合成。Li和Osakabe首次 从裸子植物松树中克隆了CCoAOMT基因，发现其对咖啡酞C0A的活力是5-羟基阿魏酞C0A的 3.2倍。目前，从拟南芥、水稻、烟草、玉米等植物中已经获取了 CCoAOMT基因。211〇1^等[19]获 得反义CCoAOMT表达的转基因烟草，Klason木质素含量下降36%~47% X-木质素比-S木质 素减少的幅度大，S/G比值增加。Meyermans等[9]在抑制CCoAOMT表达的转基因杨树中发现木 质素含量降低12%，S/G比值增加11 %。211〇1^等[19]将反义CCoAOMT转入杨树，也发现木质素 含量明显下降，且结构疏松利于脱木质素。进一步证实了CCoAOMT的功能。目前，对于白桦的 CCoAOMT基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦CCoAOMT基因序列及其功能的相关专利报 道。
【发明内容】
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[0003] 本发明提供一种从白桦中克隆白桦木质素合成基因 CCoAOMT的方法：
[0004] (1)先采用改良的CTAB法提取白桦次生木质部RNA，用ThermoScriptTM RT-PCR System反转录试剂盒，合成cDNA第一链；
[0005] (2)设计用以扩增白桦CCoΑ0ΜΤ片段的简并引物；引物序列为:正向引物:(：(：(^011'-F: 5' -AGCGATGCYCTYTAYCAGTA-3';反向引物：CC〇AOMT-R: 5' -TTCCABAGVGTGTTGTCGTA-3'
[0006] (3)利用RT-PCR和RACE方法获得基因的全长cDNA，命名为白桦CCoAOMT;
[0007] PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示；其编码蛋白的氨 基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示；
[0008] 本发明构建了白桦CCoAOMT基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pBI121-CCoAOMT)经农杆菌浸染烟草植株，获得转基因烟草植株且植物茎部木质素含量降低，表明 该基因具有降低烟草茎部木质素含量的功能并且能够调控木质素单体组分的变化。
[0009] 构建白桦CCoAOMT基因植物表达载体的技术方案如下：
[0010] 选择PBI121载体作为基本植物表达载体，在pBI121上选择Xbal和BamHI两个酶切 位点，设计带有酶切位点和保护碱基的白桦CCoAOMT引物，并克隆出白桦CCoAOMT基因全长。 双酶切质粒和白桦C C ο A 0 Μ T基因，再用T 4连接酶进行连接，检测构建的载体p B1121 -CCoAOMT〇
[0011] 本发明提供的白桦CCoAOMT基因在调节烟草次生木质部木质素含量中的应用。将 上述植物表达载体pBI 121-CCoA0MT转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的叶盘法浸染，获得 白桦CCoAOMT超表达的转基因烟草植株和转基因白桦植株，降低转基因烟草植株次生木质 部的木质素含量，与野生型非转基因植株相比，转基因烟草木质素含量降低28.4%-50.2%。构建的植物表达载体(pBI121-CC 〇A0MT)能够降低转基因烟草次生木质部中木质素 的含量，将7年生16个反义转化白桦CCoAOMT基因的白桦单株进行纤维形态和化学组分分 析，通过综纤维素含量和酸不溶木素含量两项"优先评价指标"评价分析，筛选出1、4、12、16 四个具备优势的纸浆用转基因单株，为今后利用转基因技术降低白桦木质素含量的研究提 供了理论基础与基因资源。
[0012] 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
[0013] 1、本发明提供了降低植物木质素含量的白桦CCoAOMT蛋白，可用于改进与植物木 质素含量，并且可用于搜寻在其他植物中调控木质素合成的相关基因。
[0014] 2、本发明提供的含有白桦CCoAOMT基因重组载体，可有效控制植物的木质素含量。
[0015] 3、本发明提供的白桦CCoAOMT基因具有调控植物木质素含量的功能，可用于植株 木质素含量相关的发育研究中，并为植物木质素合成相关基因的功能研究提供参考资源。
[0016] 4、本发明提供了反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦的综合指标测定，筛选出 制作纸浆用的优势转基因植株，为转基因植株在造纸方面的研究提供了参考资源。
【附图说明】
[0017] 图1为白桦CCoAOMT基因全长cDNA的PCR扩增显示图。
[0018]图2为植物表达载体T-DNA区域基因结构示意图。
[0019] 图3为植物表达载体pBI121-CCoA0MT PCR鉴定示意图。
[0020] 图4为反义转化白桦CCoAOMT转基因烟草植株与非转基因烟草植株组织化学染色 对比图。
[0021] 图5为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦的纤维长度分布频数示意图。
[0022] 图6为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦样本化学组分测定结果示意图。
[0023] 图7为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦以综纤维素含量为优先评价指标的 化学组分排序示意图
[0024] 图8为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦以"酸不溶木素含量"为依据，进行升 序排列不意图
【具体实施方式】：
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
[0027] 实施例1:白桦CCoAOMT基因的克隆 [0028] (1)植物材料的获得
[0029] 实验材料白桦次生木质部，采自东北林业大学白桦林。采集后立即冷藏到-80°C冰 箱保存备用。
[0030] (2)白桦RNA的抽提
[0031] 白桦总RNA使用改良的CTAB法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测 总RNA的纯度和浓度。用ThermoScript? RT-PCR System反转录试剂盒合成cDNA第一链，然 后用CC〇AOMT-F和CC〇AOMT-R进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA模板2μ1，10 X Buffer 2 · 5μ1， dNTP(2.5mM)2yl，正反向引物各lyl(20yM)，rTaq DNA polymerase 0·15μ1 灭菌蒸馏水补足 SSyllCR 扩增条件为：94°C 预变性 5min;94°C 变性 lmin，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 50s