ymol/L)0.5yl，EX Taq(5U/mL)0.2yl，模板DNA 3yl，ddH2〇 nyLPCR反 应条件为：951€7111丨11;95 1€3〇8,561€3〇8,721€3〇8,30个循环；72°(：1〇11^11。
[0034] 3)以步骤2)获得的DNA为模板，用T7聚合酶体外转录制备ncRNA1351的地高辛标记 探针，探针序列为:ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAG GATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
[0035] 转录体系为：模板DNA lyg，DIG_11-UTP Mix 2μ1，5 X Transcription buffer 4μ l，RiboLock? RNase Inhibitor(40UAU)lyl，T7RNA Polymerase(20UAU)1.5yl，DEPC水定 容到20μ1，混匀。转录条件为:在PCR仪中37°C体外转录反应2h;加入ΙμL DNase I (2UAU)37 。(:处理消化DNA 30min;然后加入2μ1 EDTA(0.2M，pH8.0)终止反应；加入30μ1 DEPC处理过 的水，使总体积达到50μ1;加入1/10体积的5M乙酸铵(5μ1)涡旋混匀和3倍体积预冷的无水 乙醇（15(^1)，-20°(：放置过夜；12,000印111、4°(：离心151^11，75%乙醇漂洗2次，弃上清，空气 干燥。用50μ1 DEPC水溶解RNA探针。并向其中加入20U RNase Inhibitor，5yl分装，-80°C保 存。
[0036] 4)将羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M(野生株)分别培养至对数生长早期 ^卩，006()() = 0.5)和平台期（51'，006()() = 2.0)，采用1^2〇1法提取羊布鲁氏菌（8^^6113 melitensis) 16M的总RNA，以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M的总RNA为模版，用步 骤3)制备的探针进行Northern blot验证。
[0037] Northern b 1 〇t验证结果如图1所不，ncRNAl 351在羊布鲁氏菌（Bruce 1 la melitensis)16M的对数生长中期和平台期有转录，证明在布鲁氏菌16M中确实存在 ncRNA1351〇
[0038] 实施例3、ncRNA1351在模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的表达分析 [0039] 细菌sRNA的表达与应激条件有关，因此，可用RT-PCR的方法对ncRNA1351在酸、营 养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况进行了检测。具体 方法包括以下步骤：
[0040] 1)将培养至对数生长中期(OD6〇q = 1.2)的羊布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M (野生株)菌液进行离心，收集菌体，将菌体分别在① TSB(TSB为大豆胰蛋白胨肉汤，购自生 物梅里埃公司）7.0 (pH为7.0,标准）、②GEM7.0(营养缺乏培养基，每升培养基中含 MgS〇4.7H20 0.2g，Citric acid.H20 2.0g，K2HP〇4 10.0g，NaNH4HP〇4.4H2〇 3.5g，葡萄糖20g， 调pH为7.0)、③TSB7.0,42°C (热刺激）、④TSB4.0(酸）、⑤TSB7.0，1.5mM H2〇2(高氧)条件下， 培养30min。
[0041 ] 2)采用Trizol法提取在不同条件培养的羊布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M 的RNA，RNA用DNAse I消化后作为模版，用引物ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA和 ncRNAl351 -RT-R: GGCGGCGTTTTCGTTTC检测ncRNAl351 的表达水平，用引物 16sRNA-RT-F: CACTGGACCATTACTGACGC和 16sRNA-RT-R: ACTAAGGGCGAGGGTTGC检测 16S rRNA的表达水平， 16S rRNA 为阳性内对照基因，25μ1 PCR 反应体系为：2Xonestep SYBR RT-PCR Buffer 12·5μ1，Takara ExTaq(5U/yl)0·5μ1，RT Enzyme Mix II 0.5μ1,Forward primer(10μΜ)1μ l，Reverse primer(10yM)lyl，RNase free H2O 8.5yl，Total RNA 100ng;PCR反应条件为： 42Γ5π?η;95Γ?〇8;95Γ58,56Γ3〇8,72Γ3〇8,45 个循环。
[0042] 3)相对定量的计算采用方法分析，即Δ Ct目标基因=Ct(目标基因）_Ct(同 一样本16S rRNA); Δ ACt目标基因=ACt目标基因（实验组)-ACt目标基因（对照组），相 对倍数(实验组/对照组）= 2^Aet。实验进行3次，以TSB7.0条件为对照组(相对转录水平设 为1)，其余条件为实验组。重复实验3次，计算平均值。
[0043] 检测结果如图2所示，可以看出，ncRNA1351在酸(TSB4.0)、营养缺乏(GEM7.0)、氧 化应激条件(H 2〇2)和热(42°C)等模拟巨噬细胞内环境的应激条件下的表达量明显增加，提 示ncRNA1351可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关。
[0044] 实施例4、ncRNA1351的功能分析
[0045]为了进一步分析ncRNA1351在布鲁氏菌胞内生存和毒力中发挥的作用，构建了 ncRNAl 351的突变株和回复株，并进行了相关表型实验。
[0046] 1、ncRNA1351突变株和回复株的构建及验证
[0047] 以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M(野生株）的基因组DNA为模板，用引物 ncRNA1351-N-F和ncRNA1351-N-R扩增ncRNA1351 的N端同源臂，用引物ncRNA1351-C-F和 ncRNA1351-C-R扩增ncRNA1351的C端同源臂。以PUC19K(购自大连宝生物公司）为模板，用引 物Kana-F和Kana-R扩增卡那霉素抗性基因（Kan基因）JCR扩增产物用DNA胶纯化回收试剂 盒(购自Promega公司）回收后，将N端同源臂、C端同源臂和Kan基因等摩尔比混合作为模板， 进行融合PCR扩增。PCR扩增分两轮进行，分别命名为PCR-1和PCR-2。
[0048] (1)引物序列
[0049] ncRNAl351-N-F:GTACAAAAAAGCAGGCTTAGGTACCCCAGCATCAACATCAGCACG
[0050] ncRNAl351-N-R：GCTGACATTCATCCCAGGTGGCGCCGTAACGCAGTCAAGGAC；
[0051 ] ncRNAl351-C-F：ACTCTGGGGTTCGAAATGACCGTCTCGAAGGGCCGCATGTTT
[0052] ncRNAl351-C-R：TGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGCCTCCTTTATGTCAGGCGTTGC；
[0053] Kan-F：ATCAGGACATAGCGTTGGC
[0054] Kan-R：GGCAAGAAAGCCATCCAGT；
[0055] pBBR-F：GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
[0056] pBBR-R：AGCGCGCAATTAACCCTCAC 〇
[0057] (2)融合PCR扩增
[0058] PCR-1反应体系：
[0059]
[0060]
[0061 ] PCR-1 反应条件：94°C 5min; 94°C 30s，66 °C 30s，72 °C 60s，10个循环。
[0062] 将得到的PCR-1液稀释10倍作为第二步PCR(PCR-2)的模板，进行第二轮PCR扩增。
[0063] PCR-2反应体系：
[0064]
[0065] PCR-2 反应条件：941€511^11;941€3〇8,561€3〇8,72 1€6〇8,30个循环；72。(：1〇11^11。将 PCR-2反应产物用DNA胶纯化回收试剂盒进行切胶回收，得到的回收片段即为ncRNA1351缺 失突变盒，将其命名为ncRNA1351-NC。
[0066] (3)构建ncRNA1351缺失突变载体
[0067] 将缺失突变盒ncRNA1351-NC和pMD18-T Simple Vector(购自大连宝生物公司）进 行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将转化产物涂布氨苄（lOOyg/mL)抗性 LB平板，对平板上的抗性克隆用引物ncRNAl 351-N-F和ncRNAl 351-C-R进行菌落PCR鉴定。扩 增出1997bp DNA片段(此DNA片段为N端同源臂、Kan基因和C端同源臂的融合片段）的为阳性 克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，对质粒用ΚρηΙ酶进行酶切鉴定，经酶切获得4689bp大 小DNA片段的阳性质粒，表明ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T构建成功，其核苷酸 序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，物理图谱如图3A所示。
[0068] (4)ncRNA1351缺失突变株的筛选与鉴定
[0069] 将缺失突变载体1^1?難1351-叱-1'质粒0财与8(^1羊布鲁氏菌（8^^6 113 melitensis)16M感受态细胞充分混勾，预冷15min，然后于18kV/cm、400 Ω条件下进行电击， 电击后立即加入lmL TSB培养基重悬细菌，转入1.5mL离心管中37°C复苏24h，复苏后的转化 产物经系列稀释后涂布含有50yg/mL卡那霉素的TSA平板，37°C培养72h以上，筛选卡那霉素 抗性克隆，即为ncRNA1351缺失突变株，将其命名为16MA ncRNA1351。
[0070] (5)构建ncRNA1351回复载体
[0071 ]以羊布鲁氏菌（Brucella melitensis) 16M的基因组DNA为模板，以ncRNAl351-N-F 和ncRNA1351-C-R为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经DNA胶纯化回收试剂盒切胶回收后用 Κρη I和Pst I双酶切，与经同样酶双酶切的质粒pRRlMCS-4(参见文献Kovach M，Elzer P， Steven Hi 11 D,et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS,carrying different antibiotic-resistance casse