基于自锁式适体探针的级联扩增策略的生物分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸检测技术领域，具体涉及一种基于自锁式适体探针的级联扩 增策略用于蛋白质和小分子物质的高灵敏、高特异性的检测方法。
【背景技术】
[0002] 适体是一类人工合成的、短的单链寡核苷酸序列，常被用于生物传感、诊断和治疗 等领域。适体通常具有特定且紧凑的二级或三级结构，对其相应的目标物具有高的亲和力 和选择性。与抗体或抗体片段相比，适体具有稳定、易于合成和修饰、目标物广泛的特点，其 目标物包括蛋白、小分子、金属离子甚至细胞等。因此，适体已被广泛用于分子探针的构建。
[0003] 以适体为基础的分子探针主要包括两部分:适体序列和信号序列。适体序列能够 折叠成紧凑的二级或三级结构，同时特异性识别其目标物。一旦适体序列与目标物结合，信 号序列即可被释放产生信号。然而，在实际适体传感体系中，适体探针通常是过量的。理论 计算显示，适体在未结合目标物时，亦可发生构象转变，从而产生干扰信号，影响检测的准 确性。为了解决这个问题，一种方法是将适体探针固定在一个异相表面上，通过洗涤将多余 的适体探针洗去。这种方法能够有效避免干扰信号的产生，但是异相界面的引入会导致线 性范围受限及目标物、探针的结合效率降低的缺陷。为了避免这些问题，实现基于适体的均 相检测，另一种方法就是引入一段短的阻滞DNA分子，使其与适体序列的活性部分杂交，形 成一个阻滞链封闭的适体探针，从而抑制适体的非特异性折叠。然而，由于该阻滞链较短 (12_15nt)，双链结构的不稳定性会导致阻滞链泄露(从适体探针上脱落），进而导致干扰信 号的产生。因此，为了进一步减少干扰信号、提高检测准确性，构建一个新的、更加稳定的适 体探针是十分重要的。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决上述现有技术的不足，提供一种检测蛋白质和生物小分子物质的自 锁式适体探针及基于自锁式适体探针的级联扩增策略用于蛋白质和小分子物质的高灵敏、 高特异性的检测方法。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种用来检测蛋白质和生物小分子的自锁式适体探针，该探针至少包括两个部 分:对目标物具有特异性识别的3'端的适体序列和5'端的信号转导序列，所述5'端的信号 转导序列与部分适体序列杂交，形成5'端茎-环结构，所述5'端的信号转导序列包含切刻内 切酶的识别位点，该切刻内切酶的识别位点位于5 '端的信号转导序列的3 '端。
[0007]该设计使得自锁式适体探针在无目标物时处于自锁状态，从而使适体序列在无目 标物时不发生折叠。自锁式适体探针分子通过自身回折，使5'端的信号转导序列与部分适 体序列中互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成的，称为发夹结构(或茎-环结构）。
[0008]所述3'端的适体序列是用来结合目标物，它是通过指数富集的配体系统进化技术 (简称SELEX技术)从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以高的亲和 力和特异性与目标物结合的一段寡核苷酸序列。
[0009] 本发明设计的自锁式适体探针可以用来检测各种生物蛋白分子和生物小分子，所 述生物蛋白分子为血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)，生物小分子为腺苷。通过改变适体序 列和设计探针，该方法也可被用于其它生物分子的检测。
[0010] 优选的，当适体序列5'端部的碱基不适合与信号转导序列3'端部形成氢键时，该 探针还包括用来连接适体序列和信号转导序列的连接序列，所述连接序列用来参与形成5' 端茎-环结构，保证信号转导序列与部分适体序列可以杂交形成茎-环结构。
[0011] 优选的，该探针在3 '端的适体序列的3 '端部还连接配合序列，所述配合序列的碱 基个数为1~5个，目的是使3'端适体序列顺利打开5'端的发夹结构。
[0012] 本发明还提供一种上述探针在检测蛋白质和生物小分子物质含量中的应用。
[0013] 基于自锁式适体探针的级联扩增策略检测蛋白质或生物小分子物质的方法，包括 以下步骤：
[0014] (1)链取代扩增反应:首先将含有目标物的待检测物与自锁式适体探针结合，折叠 成三向螺旋结构，打开5'端信号转导序列与部分3'端适体序列形成的茎-环结构;上述体系 在DNA聚合酶、切刻内切酶和dNTP存在时，3 '端的三向螺旋结构作为引物触发SDA反应，产生 大量的引物序列1;
[0015] (2)双重指数型扩增滚环扩增:将步骤(1)中引物序列1与模板1杂交，在DNA聚合酶 的作用下触发第一级指数型RCA扩增反应，产生大量的引物序列2;引物序列2与模板2杂交， 在DNA聚合酶的作用下触发第二级指数型RCA扩增反应，产生大量的G-四倍体序列，插入荧 光分子后，产生荧光信号，通过检测到的荧光信号对蛋白质或生物小分子物质进行定量测 定。
[0016] 具体步骤如下：引物序列1与模板1杂交，在DNA聚合酶的作用下触发线性RCA反应， 产生一条长的单链DNA产物;该产物能够与体系中过量的模板1杂交，暴露出切刻内切酶的 识别位点，从而被切刻酶内切酶切刻，产生大量的引物序列2;而游离的引物1/模板1复合物 进行下一个聚合、切刻循环，完成第一级指数型RCA扩增反应;最后，引物序列2与模板2杂 交，在DNA聚合酶的作用下触发第二级指数型RCA扩增反应，产生大量的G-四倍体序列，插入 荧光分子后，产生荧光信号通过检测到的荧光信号对蛋白质或生物小分子物质进行定量测 定。
[0017] 若是待检测物中不含有目标物时，不发生链取代扩增反应和双重指数型扩增滚环 扩增反应，插入荧光分子后则不产生荧光信号。
[0018] 具体包括以下步骤：
[0019] ⑴绑定诱导的链取代扩增(SDA)
[0020] 将含有目标物的待检测物和上述自锁式适体探针进行第一次孵育反应，孵育之后 加入具有链置换活性的DNA聚合酶、切刻内切酶、dNTPs、缓冲液和水进行第二次孵育反应， 最后通过加热使SDA反应终止;具体反应步骤如下：
[0021] 将含有目标物的待检测物和自锁式适体探针(50ηΜ，5μυ在37°C下孵育lh;随后加 入0.4yL KF聚合酶、0.2yL Nt.BbvCI、4yL 2mM dNTPs、2yL Cutsmart和3.4yL水，37°C下孵 育2.5h;最后通过80 °C加热1 Omin使SDA反应终止。
[0022] (2)连接反应
[0023] 向步骤（1)中的扩增产物中加入模板1，T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液和水，进 行模板1环状连接反应;具体反应步骤如下：
[0024] 向上述20yL SDA扩增产物中加入1.4yL ΙΟμΜ模板l、0.3yL T4 DNA连接酶、3.0yL T4 DNA连接酶缓冲液和5.3yL水，37 °C下反应40min。
[0025] (3)双重指数型滚环扩增(DE-RCA)
[0026]取步骤(2)中的连接产物，加入模板2、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲液和dNTPs和 水进行扩增反应，最后通过加热使DE-RCA反应终止;具体反应步骤如下：
[0027] 取上述30yL连接反应产物，加入1.4yL ΙΟμΜ模板2、0.4yL phi 29DNA聚合酶、0.4μ LNt · BbvCI、5yL Cutsmart、10yL dNTPs和22 · 8yL水，37°C下反应5h;该步反应通过80°C加热 lOmin终止。
[0028] (4)荧光检测
[0029] 取步骤(3)中的扩增产物，加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)进行反应，最后采用荧 光仪进行荧光测定;具体反应步骤如下：
[0030] 取上述DE-RCA产物，加入5yL 2mM KC1 和5yL 0.08mM NMM，37°C 下反应40min。最后 用Hitachi F-7000荧光仪进行荧光测定，激发波长选择399nm，发射波长的收集范围选择 550~680nm，最终选择612nm处的荧光强度考察方法的灵敏度。
[0031]优选的，所述5'端的信号转导序列如SEQ ID N〇:l所示。
[0032] 优选的，所述5'端的信号转导序列为5'-GCT GTG GAT ACT GCT GAG GCC A-3'，如 SEQ ID No :1所示。
[0033] 根据检测的目标物不同，更换相应的3'端适体序列和连接序列。当目标物为与癌 症相关的血小板源生长因子BB(H)GF-BB)时，优选的，PDGF-BB的适体序列为5'-CA GGC TAC GGC ACG TAG AGC ATC ACC ATG ATC CTG-3'，如SEQ ID 叱：2所示，连接序列为5'-〇^-3'， 配合序列为5'-TG-3'。当目标物为腺苷时，优选的，腺苷的适体序列为5'-AC CTG GGG GAG TAT TGC GGA GGA AGG T-3'，如SEQ ID No:3所示，连接序列为5'-CCACAG-3'，配合序列为 5'-CTGT-3'。
[0034] 优选的，所述切刻内切酶为切刻酶Et. BbvCI，相应的切刻酶Et. BbvCI的识别位点 序列为5'_GCT GAG G-3'。
[0035] 优选的，所述模板1的序列形成环状后包括一段引物序列1的互补序列和和两个引 物序列2的互补序列，各个引物序列2的互补序列之间、引物序列2的互补序列与引物序列1 的互补序列之间均通过切刻内切酶识别位点序列相连接。优选为5 ' -TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTG AGT GCT GAG GCT GTG GA-3'，如SEQ ID No:4所示，其中划线 序列为切刻内切酶的识别位点。其中，所述引物序列1为上述SDA反应的产物，所述引物序列 2是上述第一级指数型RCA扩增反应的产物。
[0036] 优选的，所述模板2的序列形成环状后包括一段引物序列2的互补序列和两个G-四 倍体序列的互补序列，各个G-四倍体序列互补序列之间、G-四倍体序列的互补序列与引物 序列2的互补序列之间均通过切刻内切酶识别位点序列相连接。优选为5 ' -AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA