一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种Nrf 2-ARE通路激活剂的制备方法，具体涉及一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]高F值寡肽混合物是一个由由3?7个氨基酸残氨基酸残基所组成的混合小肽(或称寡肽)体系。F值(Fischer rat1)是指支链氨基酸(BCAA: Val，lie，Leu)与芳香族氨基酸(△△六:1'印巧^?1^)含量的摩尔数比值。正常人的血液中？值为3.0-3.5，而患有肝脏疾病病人的F值只有1.0或者更低，而高F值寡肽的F值应大于20，远高于人体中这两类氨基酸的比值。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。
[0003]鲣鱼(Katsuwonus pelamis)，属鲈形总目、金枪鱼亚目、金枪鱼科、舵鲣亚科、鲣属，又名正鲣、炸弹鱼、坚鱼、松鱼、飞虎鱼。鲣鱼是大洋性重要经济鱼。鲣鱼分布范围较广，在印度洋、太平洋和大西洋水温高于15摄氏度以上的水域，都有鲣鱼的踪迹，并且储量丰富、开发利用前景乐观。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2_ARE通路激活剂的制备方法。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活剂的制备方法，其包括以下步骤:
I)金枪鱼碎肉的酶解:取金枪鱼碎肉匀浆，按固液比I g:1OmL?15 mL加入Gly-NaOH缓冲液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH调节pH到9.0?10.0，将溶液温度调制55?65°C，按照金枪鱼碎肉质量的1.0 %?1.5 %加入碱性蛋白酶(酶活力2 1.95X105 U/g)，酶解时间
3.5h?4.0 h后，酶解液于90?95°C保温10?15min，灭酶活;将酶解液温度调至45?55°C，调节pH到6.0?7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.8 %?1.0%加入复合风味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^^1]/^)，酶解时间2.5 h?3.0 h，酶解液于90?95°C保温10?15min后降至室温，于8000?10000 rpm离心15?20 min，取上清液。
[0006]2)金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备:取上述上清液，采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液;将超滤酶解液调pH值至2.5-3.5,按照物料与活性炭颗粒比为10?15:1将超滤酶解液以0.3?0.5mL/min流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用2?3倍柱体积的1:1比例的lmol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽;将活性炭精制多肽配成10?20 mg/mL的溶液，调pH值至6.5?7.5，缓慢加入到物料与D1I大孔树脂比为1?15:1的装载D1I大孔树脂的玻璃柱中，用2?3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用2?3倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。
[0007]3)金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备:将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2-ARE通路激活剂。
[0008]作为优选，所述步骤I)中的金枪鱼为鲣鱼(Katsuwonus pelamis)。
[0009]作为优选，所述步骤3)的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为: 凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20?30 mg/mL的溶液，
经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.5?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响，选择Nrf2蛋白质水平最高组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对Nrf2蛋白质水平的影响得I个活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI_MS测定分子量为658.76 Da0
[00?0]再优选，所述反相高效液相色谱条件为:进样量10?15 yL;色谱柱KromasiI Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流动相:水-乙腈梯度洗脱(O?40min乙腈浓度由O匀速升至50%);洗脱速度0.8?1.0 mL/min;紫外检测波长220 nm。
[0011]与现在技术相比，本发明所提供的一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVff)对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受氧化应激产生的活性氧的损伤;可用作制备肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf 2-ARE通路密切相关的疾病的药品或保健食品。
【附图说明】
[0012]图1是本发明的葡聚糖凝胶SephadexG_15层析图。
[0013]图2葡聚糖凝胶SephadexG_15制备酶解物的反相高效液相色谱色谱图。
[0014]图3Ile-Glu-Leu-Val-Trp (ffiLVW)对Nrf2蛋白质表达水平的影响。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]实施例:
一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法的制备方法，制备工艺流程如下:金枪鱼碎肉—双酶酶解—酶解物—超滤—活性炭吸附—大孔树脂纯化—金枪鱼高F值寡肽—凝胶过滤层析—高效液相色谱制备—Nrf2-ARE通路激活剂。
[0017]I)金枪鱼碎肉的酶解:取鲣鱼碎肉匀浆，按固液比I g:12 mL加入Gly-NaOH缓冲液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH调节pH到9.3，将溶液温度调制60°C，按照金枪鱼碎肉质量的1.2 %加入碱性蛋白酶(酶活力M.95X105 1]/^)，酶解时间3.5 h后，酶解液于95°C保温12 min，灭酶活;将酶解液温度调至50°C，调节pH到7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.9%加入复合风味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^?1]/^)，酶解时间3.0 h，酶解液于95°C保温15min后降至室温，于9000 rpm离心15 min，取上清液。
[0018]2)金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备:取上述上清液，采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液;将超滤酶解液调pH值至3.0，按照物料与活性炭颗粒比为12:1将超滤酶解液以0.3mL/min流速缓慢加入到装载活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用3倍柱体积的1:1比例的lmol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽;将活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液，调pH值至7.0，缓慢加入到物料与DlOl大孔树脂比为15:1的装载DlOl大孔树脂的玻璃柱中，用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。
[0019]3)金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备:将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得