米，行距1. 2米；F2群体大小为193个单株，按每行25株，株距和行距同亲本，在始花 期调查亲本、Fi及F 2单株株高表型。第三年，在中国农业科学院即墨试验农场种植亲本、Fi 及F2 : 3群体，F2 : 3群体大小143个株系，每个株系种2行，每行10株，2个重复，调查每个 : 3株系所有单株株高表型，以株系平均值代表该株系表型值。
[0033] 3. DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
[0034] 参考Chen (1999)等的CTAB法提取亲本及F2群体每个单株的全基因组DNA。根据 表型鉴定结果，从F 2群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合DNA，构建两 个极端池，选取Bindler等（2011)公布的1238对SSR标记，合成引物。以双亲、Fi和两个 极端池基因组DNA为模板，聚合酶链式（PCR)反应。PCR反应的产物通过8%非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带， 对后代株系的带型进行判别记录。从1238对SSR标记中筛选出122对在亲本间表现多态 的标记，进而筛选到17对在两个极端池间表现差异的SSR。同时，17对多态性SSR标记被 用于分析193个F 2个体，获得相应基因型。
[0035] 实验用Taq DNA聚合酶、dNTP及染料genefinder有北京天跟生化科技有限公司提 供。所用SSR序列来源于网上公开数据（Bindler et al.，2011)。SSR引物合成有上海生 工生物工程有限责任公司合成。
[0036] SSR-PCR 合成体系为：1X 的 PCR Buffer，l. 5mmol/L MgC12，150ymol/L dNTPs， 150pmol/L 引物，LOU Taq 酶，40ng DNA，加 ddH20 补足 20μ1。PCR 反应程序为 94°C 预变 性5min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，运行35个循环；最后72°C延伸 5min〇
[0037] PCR产物电泳及染色：扩增产物中加入6X1 Loading Buffer，94°C变性5min，取 出后置于冰水中迅速冷却。用8%变性聚丙烯酰胺胶（7M尿素，丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺 =19 : 1)对扩增产物进行分离。电泳时，首先在恒功率60W条件下，预电泳20分钟，然后 恒定功率（P = 100W)条件下对扩增产物进行分离。电泳产物用genefinder染色。
[0038] 4.烟草株高发育性状主效QTL定位
[0039] 根据F2单株个体扩增条带所表示的基因型，将其对应的株高（包括F2单株表 型和相对应的F 2 : 3株系株高平均值）调查结果作为表型值，进而利用完备区间作图软件 Icimapping3. 2进行数据分析，L0D的阈值设为2. 5,其中，permutation times设为1000 次。
[0040] 在不同群体不同环境条件下一个影响烟草株高发育性状的主效QTL，命名为 qPH-12,位于烟草12号连锁群区间PT53703-PT60823之间，在？2群体中可以解释12. 9%的 表型遗传变异，在F2 : 3群体中可以解释13. 8 %的表型遗传变异（表1)，该基因座位上来自 抗88等位基因降低株高性状。
[0041] 表1在F2和F2 : 3群体中检测到的烟草株高相关主效QTL定位
[0042]
[0043] a.下划线标记表示更靠近QTL的一侧标记
[0044] b.加性效应系指抗88等位基因被NC82等位基因代替的效应。
[0045] (二）基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL验证和紧密连锁分子标记发掘
[0046] 1.供试材料及田间表型鉴定
[0047] 用作关联分析的自然群体由96份种质资源组成，包括86份烤烟类型种质、2份白 肋烟类型种质、1份雪茄烟类型种质和7份晒晾烟类型种质作为关联分析的自然群体。自然 群体分别在两个山东即墨（纬度35. 4,经度119. 3)和四川凉山（纬度27. 3,经度101.5) 两个环境条件下种植，每个品种种质2行，每行25株，3次重复，株距0. 5米，行距1. 2米，每 份材料选择10株有代表性的植株在始花期调查株高性状。利用SAS 8. 0软件进行表型性 状基本统计量的分析。
[0048] 2. DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
[0049] DNA提取、SSR产物扩增及电泳同连锁分析方法中描述；
[0050] 3.基于关联分析的烟草株高发育性状主效QTL定位及紧密连锁分子标记发掘
[0051] 首先利用均与分布在烟草24条连锁群上的SSR标记对96份自然群体进行基因型 分析，然后利用structure. 2对自然群体进行群体结果分析，结果表明96份材料可分成两 个次级群体（K = 2);相应的Q矩阵作为协变量进行关联分析。然后在主效QTL位点qPh-12 所在12号连锁群上加密标记，共利用46个SSR标记进行关联分析，SSR标记列表见表2,标 记引物序列已经被Bindler等（20110)公布。
[0052] 表2用于关联分析的SSR分子标记
[0053]
[0054] L0055」
[0056] 采用定位软件Tassel4. 0-般线性模型（GLM)开展标记与性状的关联分析，GLM分 析中以Q矩阵作为协变量进行回归分析。结果表明，在两种不同环境条件下，总共有3个标 记与株高性状显著关联（P < 〇. 01)，其中标记PT55174在两种环境下都表现为与烟草主效 性状显著关联（表3)。
[0057] 表3基于关联分析的烟草株高性状主效QTL定位及紧密连锁分子标记发掘
[0058]
[0059] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，其特征在于，建立一种获 得烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括以下步骤： A) 获得烟草株高性状的表型，在不同年份和不同地点在始花期调查株高性状； B) 基于连锁分析的烟草主效QTL定位，其中包括： 1) 采用CTAB方法提取亲本和群体基因组DNA， 2) 根据表型鉴定结果，从F2群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量混合 DNA，构建两个极端池，进而在双亲及两个极端池间筛选与目标性状连锁的SSR分子标记， 鉴定出的标记进一步在整个F2群体中分析基因型， 3) 主效QTL定位分析，利用F2群体SSR基因型，结合F2和F2:3两年表型数据，进行QTL 定位，利用的分析软件为Icimapping3. 2, LOD阈值设为2. 5,当某一位点的LOD值大于2. 5 时即认为该处存在一个显著QTL位点，采用的统计学方法为完备区间作图法，并估算相关 遗传参数，相关遗传参数包括QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率和显性贡献 率； C) 基于关联分析的烟草株高QTL定位，根据连锁分析定位结果，在所在区间加密SSR标 记，利用加密的SSR标记分析自然群体，结合连续两年不同地点的表型数据，进行关联分析 作图，对相关QTL位点进行关联分析验证，同时进一步缩小QTL所在标记区间位置，发掘影 响烟草株高性状的主效QTL紧密连锁的分子标记。2. 根据权利要求1所述的获得方法，其特征在于：还包括发掘一个影响烟草株高发育 性状的主效QTL，命名为qPH-12,与所述SSR标记PT55174紧密连锁，位于烟草12号连锁群 区间？了53703^^60823之间，在？ 2群体中可以解释12.9%的表型遗传变异，在？2:3群体中 可以解释13.8%的表型遗传变异，在自然群体中两年分别解释的表型遗传变异为13.9% 和 14. 4%〇3. 根据权利要求1所述的获得方法，其特征在于：所述与烟草株高发育性状QTL紧密 连锁的分子标记PT55174,该标记的上游序列为SEQ ID NO. 1 (TGCTTCCTGCTTCATACGTG)，下 游引物序列为 SEQ ID N0.2(GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC)。
【专利摘要】本发明公开了一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，建立一种获得烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括烟草株高性状的表型获得；基于连锁分析的烟草主效QTL定位；以及基于关联分析的烟草株高QTL定位。本发明建立了一种烟草株高形态发育紧密连锁分子标记发掘的方法，同时在国际上首次在烟草12号连锁群上定位到一个新的影响株高发育的主效QTL，发现一个与之紧密连锁的分子标记PT55174。建立的数量性状主效QTL发掘方法和鉴定的分子标记对烟草株高主效基因的克隆和新品种选育具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105624277
【申请号】CN201410704784
【发明人】杨爱国, 程立锐, 罗成刚, 蒋彩虹, 任民, 张玉, 冯全福
【申请人】中国农业科学院烟草研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月28日