检测hla-b*5801等位基因的多色荧光pcr试剂盒及方法
【技术领域】
[00011本发明涉及一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，本发明还涉及 检测HLA-B*5801等位基因的方法，属于基因诊断领域。
【背景技术】
[0002] 人类白细胞抗原(Human leukocyte antigens，HLA)是人类主要组织相容性复合 体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。 HLA分为三类：I类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛表达于各组织有核细胞表面；Π 类分 子为HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要表达于B细胞和抗原提呈细胞，I类和II类抗原都与器 官移植有关，其中Π 类抗原更为重要；m类分子为补体成分。HLA是迄今已知基因中等位基 因多态性最高的基因复合体，目前已经证实包含超过2700多种等位基因。HLA是人类最复杂 的遗传多态性系统，其多态性存在明显的族群特征。近年来发现一些药物的严重不良反应 与人类白细胞抗原基因多态性有关，如HLA-B*5801等位基因与别嘌醇所致Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症（Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis，SJS/TEN)相关。
[0003] 别嘌醇(Allopurinol)是一种能抑制尿酸合成的药物，在高尿酸血症等症的治疗 领域发挥着重要作用。临床主要用于:原发性和继发性高尿酸血症，尤其是尿酸生成过多而 弓丨起的高尿酸血症;反复发作后慢性痛风者;痛风石;尿酸性肾结石和(或)尿酸性肾病;有 肾功能不全的高尿酸血症。然而该药易引起严重的皮肤反应，别嘌醇药疹因潜伏期长、病情 重、易复发和病死率高而受到重视。药疹是最常见的别嘌醇药物过敏反应，大多数的药疹表 现比较轻微，可以通过停药相应治疗好转。近5%的别嘌醇服用患者出现严重皮肤及其附件 损害，主要表现为重症药疹，如：剥脱性皮炎、重症多形红斑型药疹、中毒性表皮坏死松解 症。这些严重的皮肤药物不良反应若不加以积极的干预和治疗，死亡率很高，可达26%。
[0004] HLA-B*5801是HLA-B的一个基因亚型，已有大量研究证明别嘌醇相关的严重超敏 反应与白细胞抗原HLA-B*5801密切相关，在服用别嘌醇后出现严重不良反应的患者中 100 %存在，而在未出现不良反应的患者中其携带率仅为10% ;中国汉族人中HLA-B*5801阳 性者比白人高（12%vs 2%)，发生超敏反应的风险更大。临床上已经建议在使用别嘌醇前， 应该进行HLA-B*5801等位基因的检测，以判断是否属于高危人群，从而有效降低由别嘌醇 引起的严重不良反应。美国风湿病学会已经正式发布了痛风治疗指南，黄嘌呤氧化酶抑制 剂别嘌醇和非布司他是首选的降尿酸的药物。但是对于特定的人群，如所有中国汉族人、泰 国裔、韩国裔同时有3级以上CKD(慢性肾衰），由于人类白细胞抗原(HLA-B*5801)阳性率高， 发生别嘌醇相关的严重过敏性药疹危险性增高，在使用别嘌醇前，应该进行HLA-B*5801快 速PCR检测。并且台湾卫生署也建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA-B*5801基因检测，结 果阳性患者应禁止使用该药物。因此，研究一种快速、特异性高的PCR方法对HLA-B*5801等 位基因进行检测是非常必要的。
[0005] 目前用于HLA-B*5801基因型鉴定的方法包括PCR-SBT法、PCR-SSP法、PCR-SS0P法。 具体如下:PCR-SBT法，即基于测序分析的聚合酶链反应，主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、 测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。主要不足是灵敏度不高，可能出现假阴性结果； 对试剂和仪器有特殊要求，不易普及;操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。PCR-SSP 法，其原理是根据已知HLA基因片段设计特异性引物直接进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶 电泳电泳分析，缺点是操作复杂且容易污染。PCR-SSOP法，即序列特异性寡核苷酸探针，首 先对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对产物进行标记，然后针对扩增产物设计系列 寡核苷酸探针固定，最后将产物与探针杂交、放射自显影。该技术灵敏度高，特异性较强，结 果直观，但是由于其所使用的载体多为膜或滴定板，对于复杂的HLA等位基因来说，不具有 集成化的优点，而且洗脱比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化。
[0006] 针对于传统的HLA分型方法，实时定量PCR法是在普通PCR反应体系中加入荧光染 料或荧光基团，利用信号积累检测整个PCR反应的进程，它是将荧光值得积累与PCR产物扩 增的过程相结合，最后通过标准曲线或测量指数扩增期的荧光值来进行定量或者定性的方 法，基于实时定量TaqMan探针及ARMS技术已成功应用于基因分型的检测，其优点主要有灵 敏度高、特异性强、操作简便、耗时短、通量相对较高、无污染等特点。而多色荧光PCR方法可 以实现在同一PCR反应过程中对多个靶标序列的检测，从而进一步提高检测的通量。因此， 将多色荧光PCR结果ARMS法应用于HLA等位基因的分型检测是PCR分子诊断技术领域的一项 创新。
[0007] 但是，由于HLA基因家族的序列多态性，相对于HLA等位基因的检测，该技术至今很 少应用于HLA-B*5801等位基因的检测，其根本原因是多个HLA-B等位基因与HLA-B*5801具 有极高的序列同源性（90%以上），因而设计一套适用于多色荧光PCR反应高特异性扩增 HLA-B*5801等位基因的引物探针组合十分困难。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒及方 法，以解决上述问题。
[0009] 本发明采用了如下技术方案：
[0010] 本发明提供一种检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，其特征在于，包 括：
[0011]检测基因 HLA-B*5801的两个正向引物、两个反向引物及三个检测探针的检测引物 探针组合，包括检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物 探针。
[0012] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征：其中，检测基因 HLA-B*5801的第一正向引物F1为：HLA-B*5801F1 :5'_ GGCGGGTCTCAGCCCCTCCTCG-S^B -R1^：HLA-6^580^1:5^ CCCACTGCCCCTGGTACCCGCGC-3'。
[0013] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征：其中，检测引物探针包括:第一检测探针：5 ' -FAM-ACACGGAACATGAAGGCCTCCGC-BHQ2-3,。
[0014] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征:检测引物探针包括:第二检测探针：5 ' -J0E-TCGGGCCCCAGGTCGCAGCCATA-BHQ2-3，。
[0015] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征：
[0016]检测引物探针包括：第三检测探针：5 ' -CY5-CTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGT-BHQ2-3，。
[0017] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征:其中，检测基因 HLA-B*5801的第二正向引物F2为:5 ' -TTCTGACTCTTCCCATCAGACC-3,，
[0018]第二反向引物1?2为：5'-〇0^0：7^0：0^1'(：11^66-3'。
[0019] 进一步，本发明的检测HLA-B*5801等位基因的多色荧光PCR试剂盒，还可以具有这 样的特征:其中，检测内参基因的正向引物为:5 ' -CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3 ' ；
[0020] 检测内参基因的反向引物为:5 ' -GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3 ' ；
[0021] 检测内参基因的检测探针为:5 ' -R0X-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3 '。
[0022]本发明还提供一种检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，包括如下步骤： [0023] 第一步:准备待检测DNA
[0024] 第二步:PCR反应体系配制
[0025] 在荧光PCR专用管内按照下列配方配制PCR反应体系：
[0026] PCR 反应液，25μ1;基因组 DNA，约 100ng; ddH20，加至 50μ1;
[0027] 第三步:上机检测
[0028] 按照下列步骤设置温度循环及信号采集程序：
[0029] 温度为95°C，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性:温度为95°C， 时间为15秒，退火:温度为60 °C，时间为20秒，延伸:温度为72 °C，时间为30秒。
[0030] 第四步:分析结果
[0031] 在第三步中的PCR反应体系及温度循环条件下，在内控信号形成正常对数扩增"S" 型曲线的前提下，观察反应体系内特异性检测荧光信号是否都形成对数扩增"S"型曲线，若 都形成"S"型曲线则该待检DNA样本为HLA-B*5801等位基因的阳性。
[0032] 进一步，本发明的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，还可以具有这样 的特征:其中，PCR反应液包含PCR反应的缓冲液、镁离子、dNTP、核酸聚合酶，以及如权利要 求2-7中的正向引物、反向引物和探针。
[0033] 进一步，本发明的多色荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，还可以具有这样 的特征:第一步中，待检测DNA浓度应不小于50ngAU ;0D260nm/0D280nm在1 · 7~2 · 0之间。 [0034]发明的有益效果 [0035] (1)节省耗材和时间、简单易行、高通量
[0036]基于本发明的引物设计及PCR反应特点，使得本发明可以很大程度上节省时间和 耗材，检测过程只需要1小时~1.5小时，操作简单易行，整个实验可在2.5小时内完成。 [0037] (2)结果可靠、灵敏度高
[0038]采用本发明方法与HLA等位基因分型"金标准" PCR-SBT测序以及PCR-SSP进行方法 学对比，所有样本结果完全吻合。本发明方法在引入多色荧光方法提高准确度与灵敏度外， 同时，使用本发明方法可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测，因此，更适用于 临床分子诊断。
[0039] (3)成本低、无污染
[0040]由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此 技术未涉及重复开盖等二次污染的可能，本发明可直接根据探针的荧