一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，属于发酵法生产氨基酸衍生物的技术领域。
【背景技术】
[0002]四氢嘧啶(Ectoine)，又叫1，4，5，6_四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文学名为1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid。它是一种环状氨基酸衍生物，相对分子量142.16,分子式为C6H1QN2O2，其分子结构上具有的一个氨基和一个羧基使其具有氨基酸的两性性质。四氢嘧啶是微生物细胞的能源物质、渗透压调节物质和细胞及大分子物质的生物保护剂，可以缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的毒害作用。由于四氢嘧啶是所有已知的相溶性溶质中对生物细胞及大分子物质保护效果最好的，所以近年来它在化妆品、酶工业及生物医药等领域的应用也日益受到关注。
[0003]四氢嘧啶的生产方法有提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制，分离纯化困难，收率低，产品纯度低，污染环境严重，大量生产成本高，难以实现工业化生产。而发酵法生产具有原料成本低、反应条件温和、易于实现大规模生产等优点。
[0004]现有技术是从嗜盐菌细胞中提取四氢嘧啶。专利申请201410754792.1提供了一种四氢嘧啶的提取工艺，主要包括预处理、四氢嘧啶溶出、活性炭脱色、电渗析脱盐、浓缩、离子交换、浓缩、冷冻结晶等步骤。该方法预处理涉及离心收集菌体、干燥、粉碎、加水使四氢嘧啶溶出等步骤，工艺繁琐复杂，离心、粉碎能耗高。同时由于嗜盐菌培养中使用较高浓度的NaCl，因此在提取四氢嘧啶过程中需要电渗析和阳阴离子交换树脂两步脱盐工艺，含酸碱废水的排放量大。专利申请201110097221.1提供了四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，该方法需使用水低渗冲击释放四氢嘧啶，并使用芳香族聚酰胺复合膜脱盐，膜分离成本高，提取收率低。最近的研究中一种新型基因工程大肠杆菌的使用可以使四氢嘧啶大量积累到发酵液中(申请号201510410080.2)，该基因工程大肠杆菌可以将四氢嘧啶分泌到发酵液中且培养基中无需添加高浓度的NaCl。因此，本发明提供了一种从富含四氢嘧啶的发酵液中提取四氢嘧啶的工艺，与从嗜盐菌细胞中提取四氢嘧啶的工艺相比，本工艺简单易行、分离效率高、分离成本低、极具工业化价值。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种新型的四氢嘧啶的分离提取工艺，克服现有生产工艺中存在的工艺路线复杂，分离纯化困难，能耗水耗较多等问题。
[0006]本发明为了实现上述目的而采取的技术方案概述如下:
[0007]本发明从富含四氢嘧啶的发酵液中分离提取四氢嘧啶，首先利用双膜系统即微滤膜、超滤膜分离系统过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶晶体。
[0008]本发明技术方案具体包括如下步骤:
[0009]a、取富含四氢嘧啶的发酵液，用盐酸调节pH为3.0-6.0后栗入微滤膜分离系统，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，得到除去菌体的四氢嘧啶微滤液；
[0010]b、将a步获得的微滤液栗入超滤膜分离系统，对微滤液进行除蛋白和脱色处理，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，得到除去蛋白和色素的四氢嘧啶超滤液；
[0011]c、将b步获得的超滤液栗入离子交换柱，经阳离子交换树脂吸附，进样流速为IBV/h，吸附饱和后采用0.02-0.2mol/L的氨水洗脱，洗脱流速为0.05_2BV/h，收集pH=7_12的四氢嘧啶高流分洗脱液；
[0012]d、将c步获得的高流分洗脱液加入0.05%-5%(m/v)的活性炭脱色，温度20-40V，搅拌脱色10-30min，过滤获得四氢嘧啶脱色液；
[0013]e、将d步获得的脱色液减压浓缩至原体积的5%_15%，加入乙醇沉淀获得四氢嘧口定粗品；
[0014]f、将e步获得的四氢嘧啶粗品重新溶解于去离子水至饱和，4°C下静置结晶后过滤获得晶体，60°C干燥后得到四氢嘧啶成品。
[0015]进一步地，上述步骤a中的微滤膜分离系统采用中空纤维微滤膜，微滤膜孔径为
0.02-0.2μπι，操作温度为25-45°C，操作压力为0.05-0.2MPa。
[0016]进一步地，上述步骤b中的超滤膜分离系统采用中空纤维超滤膜，超滤膜孔径为
0.001-0.Ο?μπι，操作温度为25-45°C，操作压力为0.1-0.5MPa。
[0017]进一步地，上述步骤c中的阳离子交换树脂可以是凝胶型树脂，也可以是大孔型树脂。
[0018]更进一步地，上述步骤C中的阳离子交换树脂具体可以为001*7，D072，D061树脂中的一种，优选D061。
[0019]进一步地，本发明还提供一种检测上述四氢嘧啶成品纯度的方法，使用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温30°C，流动相为2%乙腈，流速lmL/min，紫外检测波长210nm。
[0020]有益效果:
[0021]与现有工艺相比，本发明的方法具有以下优点:
[0022]I)本发明采用双膜系统去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，与离心收集菌体相比，能耗较低，菌体和蛋白质的截留率较高。
[0023]2)本发明根据四氢嘧啶两性电解质的特点利用阳离子交换树脂对四氢嘧啶吸附，能有效除去发酵液中无机盐阴离子、乙酸等杂质。同时由于无机盐阳离子与阳离子树脂的结合能力较强，在使用氨水洗脱的时候可以通过控制氨水浓度和洗脱流速，选择性的将四氢嘧啶优先洗脱下来，洗脱液中的铵根离子则可以在减压浓缩过程中挥发出去，从而有效实现了四氢嘧啶的分离，避免了电渗析、阳阴离子交换树脂或纳滤脱盐等复杂操作。
[0024]3)本发明根据四氢嘧啶易溶于水微溶于乙醇的特点，通过乙醇沉淀和重结晶的方法进彳丁精制，有效提尚了广品的回收率和纯度。
【附图说明】
[0025]图1:本发明四氢嘧啶的提取工艺流程图。
【具体实施方式】
[0026]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0027]实施例1:
[0028]a、取四氢嘧啶发酵液5L(四氢嘧啶含量25.0g/L)，用4mol/L的盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液;所述微滤膜分离系统采用中空纤维微滤膜，微滤膜孔径为0.02μπι，操作温度为30°C，操作压力为0.2MPa。收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，菌体去除率为99.2%。
[0029]b、将经a步得到的微滤液栗入超滤膜分离系统，得到去除蛋白和色素的四氢嘧啶超滤液。所述超滤膜分离系统采用中空纤维超滤膜，超滤膜孔径为0.003μπι，操作温度为400C，操作压力为0.3MPa，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，蛋白去除率为80.8%,透光率为72.3 %。
[0030]C、将b步获得的超滤液以lBV/h的流速栗入D061阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用0.15mol/L的氨水洗脱，洗脱流速为0.05BV/h，收集pH为7_12的四氢嘧啶高流分洗脱液。
[0031]d、将c步获得高流分洗脱液加入3% (m/v)的活性炭脱色，温度40°C，搅拌脱色15min，过滤获得四氢嘧啶脱色液，透光率为99.8 %。
[0032]e、将d步获得的脱色液减压浓缩至原体积液的10%，加入乙醇沉淀获得四氢嘧啶粗品。
[0033]f、将e步获得的四氢嘧啶粗品重新溶解于去离子水至饱和，4°C下静置结晶后过滤获得晶体，60 °C干燥后得到四氢嘧啶成品101.3g。
[0034]g、使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定四氢啼啶。取f步获得的成品加水溶解后使用微量进样针，进样量20yL，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温300C，流动相为2%乙腈，流速lmL/min，紫外检测波长210nm。根据标准曲线计算四氢啼啶纯度为98.2%。
[0035]实施例2:
[0036]a、取四氢嘧啶发酵液5L(四氢嘧啶含量25.0g/L)，用4mol/L的盐酸调节pH为6.0，进入微滤膜分离系统，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液;所述微滤膜分离系统采用中空纤维微滤膜，微滤膜孔径为0.05μπι，操作温度为35°C，操作压力为0.15MPa。收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于I.0g/L时停止收集，菌体去除率为97.4%。
[0037]b、将经a步得到的微滤液栗入超滤膜分离系统，得到去除蛋白和色素的四氢嘧啶超滤液。所述超滤膜分离系统采用中空纤维超滤膜，超滤膜孔径为Ο.ΟΙμπι，操作温度为35°C，操作压力为0.1MPa，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，蛋白去除率为74.1%,透光率为66.5%。
[0038]C、将b步获得的超滤液以lBV/h的流速栗入001*7阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用0.2mol/L的氨水洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集pH为7-12的四氢嘧啶高流分洗脱液。