一种高转化效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域对大肠杆菌热激感受态细胞的培养及制备方法，特别是 设及对大肠杆菌菌株D册α的培养及制备方法，尤其是设及一项显著提高大肠杆菌菌株热激 转化效率和稳定性的关键技术。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌热激转化技术是基因工程和分子生物学研究的基础，在DNA片段测序、功 能载体构建和质粒扩繁等方面广泛使用。转化效率对于注重克隆数量试验来说(如文库构 建等），一直是个技术瓶颈。截至目前，除市售的大肠杆菌热激感受态细胞外，实验室自制的 感受态细胞转化效率参差不齐。也有科研机构采用电击转化代替热激转化，W提高转化效 率，但此方法需要特殊仪器设备即电转仪，试验条件要求苛刻，同时电击感受态细胞比热激 感受态细胞价格上要贵数倍。在国家大力提倡节约的大环境下，如何减少不必要的科研专 用材料费用支出，显得尤为重要。相比之下，大肠杆菌热激感受态细胞因其无需特殊设备、 制备方法简单而备受科研人员青睐，其转化原理是利用大肠杆菌处于0 °C的氯化巧低渗溶 液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的外源DNA形成抗面ase的径 基-憐酸巧复合物，附着在细胞表面，经42 °C短时间热激处理，细菌细胞能吸收外源DNA复 合物，通过在相应培养基上复苏并分裂增殖，从而实现外源DNA的大量复制。然而目前尚无 一个稳定、高效的大肠杆菌热激感受态细胞制备技术。经过本课题组多年的探索，在高转化 效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方面取得一定进展，并已成功应用在DNA测序载体、基因 功能分析载体等转化方面，取得了理想的转化效率。无论是哪种大肠杆菌菌株，常规方法是 先将大肠杆菌菌种在固体平板上复苏，过夜培养后挑单菌落在液体培养基中进行少量及后 续的大量培养，随后采用氯化巧溶液在4 °C条件下进行菌体漂洗，并保存于含10%甘油的氯 化巧保存液中，置-80 Γ长期保存。利用运种制备方案得到的大肠杆菌热激感受态细胞转 化效率十分不稳定，且不同批次、不同制备方法得到的热激感受态细胞转化效率也不同，同 时操作人员的熟练程度也影响制备的感受态细胞最终转化效率。转化效率是评价感受态细 胞优劣的核屯、标准。通过改进大肠杆菌细胞培养、漂洗环节及菌保存液成分，进一步提高制 备的大肠杆菌热激感受态细胞转化效率及稳定性，对于加快基因工程和分子生物学研究进 程具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一项从大肠杆菌菌株制备高转化效率和稳定的热激感受态细 胞的关键技术，作为分子生物学试验基础，为基因工程及功能基因组学研究提供技术支撑， 减少不必要的科研专用材料费用支出，提高科研工作效率。
[0004] -项广泛适宜于高效大肠杆菌热激感受态细胞制备的关键技术，是将-80 °C保存 的菌种（市售或实验室保存均可）用接种环在LB固体平板上（10 g/L膜蛋白腺，Oxoid货号： LP0042;5 g/L酵母提取物，Oxoid货号:LP0021;10 g/L氯化钢；12 g/L琼脂粉，Sigma货号： A5306)划线，37 °C过夜培养，挑取直径约1.5-2 mm的单菌落于5 mL LB液体培养基（lOg/L 膜蛋白腺，Oxoid货号:LP0042; 5g/L酵母提取物，Oxoid货号:LP0021; lOg/L氯化钢）中，37 °C，220巧m过夜培养，于次日下午按1:100转接于100 mL与上述同样的新配制LB液体培养 基中，200巧m室溫(20-25 °C)培养10-12 h，直至OD600达到0.4-0.6间。取出菌液置于冰水 混合物上10 min,忌晃动。随后转入50 mL锥形离屯、管(BD FALCON货号：352098,实验前预 冷），并于冰水混合物上静置5 min,置于离屯、机（Thermo Sorvall ST 16R)，在4 °C、4000 巧m离屯、10 min,取出、倒净培养液。加入等量巧0血)预冷的SB溶液（10 ml PI阳S，sigma货 号:口6757;55 1111111(：12;15 111]\1化(：12;用1((^或肥1调抑至6.7,0.22 4111孔径的无菌滤膜过滤 灭菌后4 °C保存备用），轻柔重悬菌体，冰水混合物上静置10 min,再4 °C、4000巧m离屯、10 min，取出、倒净SB溶液，并倒扣于无菌吸水纸上2 min，加入半量(25 mL)预冷的SB溶液，轻 柔重悬菌体，冰水混合物上静置10 min,同上条件离屯、10 min,取出、倒净SB溶液，并倒扣于 无菌吸水纸上2 min,加入10 mL预冷的SB溶液(此步需添加二甲基亚讽(DMS0)至终浓度为 7%)，用去头的蓝色移液管轻轻吸打菌体至完全松散，100 yL分装，垂直置于液氮中，-80 °C 保存。
[0005] 上述发明中，将大肠杆菌在室溫条件下进行过夜扩繁，设置37 Γ扩繁1-2 h为对 照，经过梯度递减漂洗后收集分装制备的大肠杆菌菌株D册α(本课题组保存)热激感受态细 胞。分别用本发明和对照制备的感受态细胞进行PUC19质粒(Takara货号：3219,大小为2686 bp)、pMD18-T与1.023 kb外源片段的连接产物（片段为小麦ARG cDNA，GenBank登录号： 1附15197;9]\?)18-1'载体化1?1^货号：6011，大小为2692 69)及94朋28与上述同样片段的连 接产物(载体为本课题组改造，空载体大小为10141 bp)转化，经37 °C、200 rpm复苏1 h后， 涂在含有抗生素的LB固体平板中，倒置37 °C过夜培养，拍照统计转化效率。
[0006] 经过反复试验和对比发现，室溫过夜扩繁，相比正常用37 °C培养1-2 h后制备的 大肠杆菌热激感受态细胞，无论在转化对照质粒(pUC19)、T载体连接产物(PMD18-T与1.023 化小麦ARG基因 cDNA全长片段的连接产物)及基因功能研究载体(pA册28与上述同样片段的 连接产物）上，转化效率显著提高。其中，转化对照质粒时，转化效率为3xl08 cfiKcolony forming units)，比对照提高5倍（图1)，转化Τ载体连接产物时，转化效率比对照提高8倍 (图2 )，转化基因功能研究载体时，转化效率比对照提高40倍（图3 )。同时，取出保存1年W上 利用该发明制备的大肠杆菌菌株DH5a热激感受态细胞，进行基因功能研究载体(ΡΑΗ028与 1.023化的小麦ARG cDNA片段的连接产物，pA朋28在载体图见图4)转化试验，发现转化效 率比新制备的热激感受态略差，对于大多数实验来说，此差别可W忽略。上述实验结果表 明，室溫、低速扩繁大肠杆菌菌株能很好地维持大肠杆菌活力，梯度递减方式漂洗菌细胞， 极大地维持细胞膜的通透性，促进大肠杆菌对外源DNA的融合，进而提高转化效率。
[0007] 下面结合附图和附表对本发明做进一步说明。
[000引 附图和附表说明 图1.本发明与对照转PUC19结果图 图2.本发明与对照转PMD18-T与1.023化外源片段的连接产物结果图 图3.本发明与对照转pA册28与1.023化外源片段的连接产物结果图 图4. PAH028载体图 表1.连接反应体系
【具体实施方式】
[0009] 下述实施例中所用水皆为超纯水，所用方法非特别说明皆为常规方法。
[0010] 实施例1、大肠杆菌菌株D册α热激感受态细胞制备 一、培养基、抗生素及相关溶液配制和灭菌 LB液体培养基：10 g/L膜蛋白腺(Oxoid货号:LP0042);5 g/L酵母提取物(Oxoid货号： LP0021);10 g/L氯化钢（国产分析纯）；调pH=7.0, W上成分采用121°C高压湿热灭菌20 min。
[0011] LB固体培养基:在LB液体培养基中仅添加15 g/L琼脂粉(Sigma货号:A5306);调抑 =7.0, W上成分采用121°C高压湿热灭菌20 min。
[0012] SB溶液：10 ml PIPES(sigma货号：P6757);55 mM MnCl2(国产分析纯）；15 ml 化Cl2(国产分析纯）；用KOH或肥1调pH至6.7，0.22 μπι孔径的无菌滤膜过滤，4 °C保存备用。
[0013] 50 mg/mL卡那霉素配制：准确称量0.5 g卡那霉素粉剂溶于10 mL超纯水中，待彻 底溶解后，0.22皿孔径的无菌滤膜过