一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗yx10 d90株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，更具体地，设及一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗 YX10 D90株。
【背景技术】
[0002] 禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染的呼吸道疾 病。主要特征为病鸡呼吸道症状，肾脏肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积，甚至外观呈"花斑 肾"；蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降，幼雌鸡感染可引起输卵管永久性退化，导致产生"假母 鸡"。除此之外，部分IBV毒株还可W引起肠道、腺胃、肌肉的病变。IBV可感染所有日龄、绝大 多数种类的鸡，尤其是是1~5周龄的维鸡非常易感，容易导致维鸡生长迟缓、增重和饲料报 酬降低、甚至死亡;并易引起霉形体混合感染和大肠杆菌等继发感染，从而导致鸡群死亡率 增高，给全球养鸡业带来巨大的经济损失，IB是严重影响世界养禽业的重大传染病之一。
[0003] IBV属于套式病毒目（Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属 (Coronavirus)，为第Ξ群禽冠状病毒的代表毒株。IBV为有囊膜的、不分节段的单股正链 RNA病毒。IBV最突出的特点是血清型众多，且不同的血清型相互之间没有或仅有很低的交 叉免疫原性。目前己经报道IBV的血清型或基因型至少有30多种，并且新的血清型、基因型 和变异株仍然不断出现，不同血清型和基因型间的交叉保护力很弱，运给IB的诊断、防治带 来了非常大的困难。
[0004] 疫苗在IBV的预防中起着非常重要的作用，目前，在我国使用的疫苗主要有灭活 苗、弱毒苗。灭活苗主要在种鸡、蛋鸡开产前使用。但是仍存在灭活苗使用量大，需要配合佐 剂，制备复杂，成本较高等众多问题。除此之外，灭活苗还不能引起粘膜免疫和细胞免疫，因 此不能对气管提供有效的保护。弱毒活苗是由驯化好的毒株通过鸡胚的连续传代致弱后制 备的。弱毒苗能有效刺激机体的免疫系统，可W同时激发细胞免疫、粘膜免疫和体液免疫， 使用方便，生产成本低。一般我们主要用于肉鸡、种鸡和蛋鸡的首免。传支弱毒活疫苗从 1956年开始在荷兰使用，册2，H120是目前全世界应用最广泛的活疫苗。尽管我国一直广泛 使用Mass型疫苗(H120、册2)，近年来肾型传支还是在国内频繁广泛的爆。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有疫苗株不能够有效防制鸡传染性支气管 炎病毒流行毒株的攻击，防制效果不理想的缺陷，提供一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗 YX10 D90株。
[0006] 本发明的第二个目的是提供所述鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株的应 用。
[0007] 本发明的第Ξ个目的是提供含有所述鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株 的药物。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的： 一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株，在2016年3月14保藏于中国典型培养 物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC N0:V201610,保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
[0009] 发明人前期对2008~2015年中国分离株S1基因进行进化分析，结果与国内学者报 道一致，类QX型IBV已成为我国最主要的IBV基因型，占分离株60%左右。类QX型与我国常用 疫苗毒株(H120、册2、LDT3A、4/91等）S1基因相似度较低（70~85%)，进化距离较远。进一步 研究发现，鸡群免疫国内主要弱毒疫苗(H120、册2、LDT3A、4/91等），然后用类QX基因型毒株 攻毒，表明商品疫苗毒株不能对目前的优势流行毒株提供足够的保护。
[0010] 本发明所述弱毒活疫苗YX10 D90株是由YX10强毒株经多次传代致弱，分离获得， 具体是使用9~11日龄SPF鸡胚对YX10株进行连续传代致弱，每个代次通过尿囊腔接种5枚 鸡胚，每胚接种2(K)yL，置37 °C解育36~4她后，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代。连续 传至90代，命名为YX10 D90。
[0011] YX10 D90株的生物学特征如下:病毒尿囊液无血凝性，接种9~11日龄鸡胚可致鸡 胚发育受阻或死亡，对SPF鸡无致病性，形态学观察为典型冠状病毒。
[0012] 本发明还提供一种多肤，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0013] 本发明还提供编码所述多肤的核巧酸序列，所述序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 经测序和分析，所述疫苗YXIO D90株的基因编码的多肤序列如SEQ ID NO:2所示； 所述疫苗YXIO D90株的基因的核巧酸序列为SEQ ID NO: 1所示，或者在SEQ ID NO: 1所述序 列基础上经替换、缺失和/或添加一个或多个核巧酸且编码SEQ ID N0:2所述蛋白同等功能 的基因序列。
[0015] 本发明还提供所述鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株在制备治疗鸡传染 性支气管炎的药物中的应用。
[0016] 本发明还提供含有所述鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株的药物；具体 地，可W是疫苗，所述疫苗包括权利要求1或4或5所述鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株和药学上可W接受的冻干保护剂。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果： 本发明提供了一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗YX10 D90株，在2016年3月14保藏于 中国典型抬养物保臧中屯、，保臧编号为CCTCC NO:V201610，保臧地址为：中国，武汉，武汉大 学;所述弱毒株对各种鸡只均安全，且无副反应，将所述弱毒株制成疫苗安全有效，可保护 同源强毒的攻毒，具有实际和广泛的应用价值。
【附图说明】
[001引图1为注射YX10 D90的弱毒疫苗的防治效果。
【具体实施方式】
[0019]下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述。本发明的设计思想 或同类物质的简单替代属于本发明的保护范围。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均 为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可 得到的配料或材料。
[0020] 实施例1传染性支气管炎病毒YXIO株分离鉴定 YX10由本实验室2010年从浙江湖州30日龄发病黄羽肉鸡中分离鉴定，具体过程如下： (一)病毒的分离培养 无菌采集病死鸡肾脏、脾脏、肺脏、气管，按体积比1:5的比例(体积比）灭菌生理盐水， 研磨，冻融3次，500化pm离屯、20min，上清液过滤除菌后尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每 胚接种0.2ml，接种后的鸡胚37°C解育，每天照胚2次，弃去24小时之内的死亡胚，48小时取5 枚收获尿囊液，其余继续解育至144小时，记录鸡胚病变情况。如此盲传5代。收获的病毒存 于-80°C。至第3代鸡胚呈现典型的传支病毒病变，表现为鸡胚发育迟缓、胚体騰缩失水等。 至第5代测定病毒含量为105'化IDso/O.lml。
[0021] (二)病毒鉴定 1、血凝性：1~5代收获的尿囊液进行血凝试验。结果各代次尿囊液对1%的鸡红细胞均 不发生凝集，病毒无血凝性，排除为正粘病毒、副粘病毒、腺病毒等有血凝性的禽类病毒的 可能性。
[0022] 2、PCR鉴定:第五代尿囊液20化1，TAKARA公司RNA提取试剂RNAiso Plus提取病毒 RNA，用N基因引物进行RT-PCR。
[OOU]上游 5 ' -CGGAGCAATAGCAAGAAAAGC-3 ' 下游：5 ' -GCAGCAACCCACACTATACCATC-3 '。
[0024] PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果在5(K)bp左右有目的条带，证明分离病毒为 IBV。
[0025] 3、传支S1基因测序与分析 第五代尿囊液200μ1，TAKARA公司RNA提取试剂RNAiso Plus提取病毒RNA，扩增S1基因， IBV S1 上游：5 ' -AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3 ' ；下游：5 ' -CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3 ' ；产 物长度1700bp左右。PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的条带清晰无杂带，直接送至华大 基因公司测序。S1基因序列拼接整理后全长1620bp。
[0026] YX10 株 S1 基因序列提交 Gene bank, Accession N〇:JX84041 1。与 H120 (抓822341)、册2(AF352315)、W93(AY842862)、M41(DQ664534)、4/91(JN192154)、LDT3-A (AY702975)疫苗株的SI基因进行多重比对，同源性较低（均低于85%)，分别为77. 9%、78. 3〇/〇、77. 5%、77. 8%、78. 6%、84.8%dS1基因编码的纤突蛋白位于病毒的表面，诱导机体产生 中和抗体，与机体的保护反应密切相关，S1基因是病毒演化过程中最易发生变异的基因，其 序列相差大于5%可能就不能产生或不能完全产生交叉保护作用。
[0027] 4、形态学观察 YX10 D90株病毒尿囊液经离屯、、憐鹤酸负染后在电镜下可见到直径约为80~12化m的 冠状毒，病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。具 有冠状病毒典型形态。
[002引 5、动物回归试验 7日龄SPF鸡20只，滴鼻点眼途径接种第五代病毒，100μΙ每只，鸡群在攻毒后2天开始出 现临诊症状，3天开始有鸡只死亡，发病率为100%(10/10)，死亡率为50%巧/10)。发病鸡表现 出轻度呼吸道症状，部分鸡精神不振，拉稀，饮水增多，采食量下降。病死鸡极度消瘦，病死 鸡只均有轻微气管粘液、出血，有气囊炎，肾脏明显肿大，呈花斑，有大量白色尿酸盐沉积。 从第14天W后临床症状逐渐出现好转，攻毒后20天，基本上恢复正常。用分离到的传支病毒 感染易感维鸡可复制出临床病例。
[0029] 6、血清中和试验 YX10株阳性血清制备：14日龄SPF鸡20只饲养于负压隔离器中，滴鼻点眼途径接种YX10 株第五代病毒，剂量0.1ml/只，10天后将没有死亡的小鸡颈部皮下注射YX10株油乳剂灭活 苗0.3ml，14天后再次颈部皮下注射YX10株油乳剂灭活苗0.5ml，10天后屯、脏采血，无菌分离 血清，按每毫升2000单位加入青链霉素，分装备用。
[0030] 与类症疾病阳性血清的交叉中和试验:将YX10株第五代毒稀释1000倍，分别与等 量的ND、I抓、口L、IB(M41)阳性血清(购自中国兽医药品监察所)及YX10阳性血清混合后，在 37°C感作60min，各接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚尿囊腔内0.2mL。病毒对照组为YX10株1〇-4稀释毒与等量盐水混合。37°C解化，观察6d，结