鸭ccl4基因启动子的克隆及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程应用和分子生物学技术领域，具体设及一个鸭CCL4基因 启动子的扩增和对其转录活性的鉴定。
【背景技术】
[0002] 基因的表达受一段位于其5 '端上游的DNA序列控制，该5 '端上游序列可被转录因 子和RNA酶识别，进而启动基因的转录，该5'端上游序列通常被称为启动子。利用启动子可 W诱导蛋白在特定的时间、部位和特定条件下表达。
[0003] 启动子是重要的顺式作用元件，在该段序列中存在一些特定序列被转录因子识别 并结合，运段序列决定基因的表达特异性和表达频率。启动子一般可分为Ξ类:1、组成型启 动子，该类启动子调控基因表达不受时空的限制;2、诱导型启动子，即在诱导剂的作用下启 动子才诱导基因表达;3、组织特异性启动子，即该类启动子在不同的组织调控的基因表达 存在差异。
[0004] 在植物中，人们利用组织或时期特异的启动子生产不同的产品取得了丰富的成 果，如抗虫棉花等。同样在大型动物中也取得了一定的成效，如利用乳腺特异的启动子指导 药用蛋白在乳腺中超表达，可使基因工程药物产业化。黄赞等成功利用山羊的0-酪蛋白基 因的启动子指导人凝血因子IX在转基因小鼠乳汁中高效表达。
[0005] 我国是鸭肉消费大国，近年来我国养鸭业不断发展，鸭的生产性能在不断选育下 大幅提高，主要表现为生长速度快，料肉比低，产蛋率高。但随着鸭生产性能的提高，养殖规 模的扩大，养鸭业也面临着各种疾病的威胁，如禽流感、鸭病毒性肝炎、传染性浆膜炎等，鸭 的成活率大幅降低。通过提高生产管理水平或使用药物和抗生素可在一定程度上减少损 失，但并不能从根本上解决问题，同时药物和抗生物的使用容易引起兽药残留、增加食品安 全风险。通过对鸭的抗病性进行研究，通过基因改良手段培育出适应当前生产环境，具有一 定抗病力的鸭品种前景将极为广阔。但能用于转基因鸭制备且拥有自主知识产权的高效表 达的启动子比较少，大大限制了转基因鸭的发展，因此，获得转录效率较高的启动子成为急 需解决的问题。因此本发明旨在构建获得适合在免疫组织中高效表达的启动子。
[0006] 趋化因子是一系列小分子蛋白质，主要在免疫组织中表达，通过受体介导粒细胞、 单核/巨隧细胞、淋己细胞、成纤维细胞的趋化性迁移和活化，从而使细胞在炎症部位具体、 活化W及组织损伤的修复等。(XL4是CC家族的一员，属前炎症趋化因子，在受体介导下， CCL4能吸引单核细胞、T淋己细胞和嗜曙红细胞，此外它还可能是机体清除有害微生物至关 重要的因子。
[0007] 到目前为止，仍没见到研究鸭CCL4基因的启动子功能的报道。所W申请人对运个 基因进行了不同长度启动子功能的研究，W期能够更好地利用该启动子。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于分离克隆鸭CCL4基因启动子区域，并构建不同长度的启动子缺 失片段，对其转录活性进行验证，w期获得此基因启动子的具备较高启动转录活性的调控 区段。克服目前鸭基因工程中可利用的启动子数目的不足。
[0009] 本发明W鸭的血液基因组DNA为模板首先扩增获得CCL4基因第一外显子上游 543bp的片段，通过测序验证其正确性，通过软件预测其是否可能为该基因的启动子。然后 W扩增获得的片段为模版扩增获得了 CCL4基因第一外显子上游区域的817bp、631bp、 554bp、397bp、295bp共5个不同长度的缺失片段，将运些片段插入到蛋火虫巧光素酶报告系 统中构建pGL3-Cl、pGL3-C2、pGL3-C3、pGL3-C4、pGL3-C5个真核表达载体，将运些载体分别 转染鸡的淋己瘤DT40细胞，通过对报告系统的蛋火虫巧光素酶的相对活性进行分析，比较 不同缺失片段的相对活性，通过分析确定扩增的上述片段为启动子区域，并获得该基因的 核屯、启动子区域。
[0010] 本发明通过W下技术实现：
[0011] 利用ht1:p: //pre. ensembl. org/Anas_platy;rhynchos/lnfo/Index捜索获得CCL4 的上游调控序列，其核巧酸序列。利用TFSEARCH和TESS等生物信息学软件预测分析核屯、启 动子区域、转录起始位点、TATA Box、转录因子结合位点等分布情况。根据预测结果设计1对 引物和5对含有酶切位点的缺失引物(其核巧酸序列见表1)，利用高保真酶从自己单位培育 鸭(含连城白鸭血统）的基因组中PCR扩增分离获得CCL4基因上游序列，通过测序保证扩增 序列的正确性，其序列如SEQ ID NO: 1所示。然后W此为模板利用5对缺失引物PCR扩增后构 建融合载体，申请人将其分别命名为pGL3-Cl、pGL3-C2、pGL3-C3、pGL3-C4、pGL3-C5。其片段 长度分别为817bp、63化9、55469、39769、29化9，其核巧酸序列分别如56〇10^:2、569 10 N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、沈Q ID N0:6所示。瞬时转染鸡的淋己瘤DT40细胞，双巧 光素酶报告系统检测发现PGL3-C3的活性最高，同其它载体的活性相比具有极显著的差异。 结果显示553bp的PGL3-C3片段具备独立的启动报告基因表达的功能。
[0012] 本发明的具体步骤如下：
[0013] 结合前期转录组测序结果选择(XL4基因，在http://pre.ensembl .org/Anas_ platyrhynchos/Info/Index上获得该基因的DNA序列，如沈Q ID NO: 10所示，根据此序列注 释寻找其第一外显子上游序列，并设计引物扩增该序列，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所 示。利用TESS、TFSEARCH等生物信息学软件对序列SEQ ID N0:1预测其核屯、启动子区域、转 录起始位点、TATA Box、转录因子结合位点等分布情况。根据软件预测的结果设计缺失引 物，W鸭的基因组DNA为模板，PCR扩增获得5个不同长度的启动子区域，序列分别如序列表 SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:6所示。将运些启动子候选片段装载到pGL3-basic双巧光素酶报 告基因上游多克隆位点（载体图及多克隆位点等信息见图2)处，装配成融合表达载体（图 3)。通过脂质体介导的转染法将融合表达载体瞬时转入DT40细胞，同时转入海肾巧光素酶 报告基因 pRL-TK为内参质粒。本发明设置阴性对照pGL3-basiC(图2)，阳性对照pGL3- control。转染4她后通过双巧光素酶报告系统对报告基因 LUC进行定量分析，进而考察验证 该启动子的不同缺失片段在不同来源细胞中的启动功能。检测结果表明pGL3-Cl、pGL3-C2、 PGL3-C3、在DT40细胞中有较强的表达，其中PGL3-C3最高，而其余两个的表达量同阴性对照 pGL3-basic无显著性差异，表明其无转录活性。结果显示554bp的PGL3-C3片段转录活性较 高且具备独立的启动报告基因表达的功能。
[0014] 本发明的优点在于：
[0015] (1)本发明详尽的验证了 CCL4启动子的各个区段在免疫来源细胞中启动基因表达 的能力，为CCL4基因的表达调控带来了更深层次的认知。
[0016] (2)本发明鉴定了启动子CCL4的核屯、区段，为基因工程和分子育种提供了新的特 异表达的启动子资源。
[0017] 更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》的内容。
【附图说明】
[001引序列表SEQ ID NO: 1，公开了本发明克隆的鸭CCL4的上游调控核巧酸序列，长度为 89f5bp。
[0019] 序列表SEQ ID N0:2是从所述的SEQ ID NO: 1核巧酸序列克隆得到的一个缺失启 动子PGL3-C1的核巧酸序列，长度为81化P。
[0020] 序列表SEQ ID N0:3是从所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一个缺失启 动子PGL3-C2的核巧酸序列，长度为63化P。
[0021] 序列表SEQ ID N0:4是从所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一个缺失启 动子PGL3-C3的核巧酸序列，长度为554bp。
[0022] 序列表SEQ ID N0:5是从所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一个缺失启 动子PGL3-C4的核巧酸序列，长度为39化P。
[0023] 序列表SEQ ID N0:6是从所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一个缺失启 动子PGL3--巧的核巧酸序列，长度为29化P。
[0024] 图1:本发明的技术路线图。
[0025] 图2:表示载体pGL3-basic结构示意图，在多克隆位点的下方包含报告基因 luc+。
[0026] 图3:构建好的WpGL3-basic为骨架的融合载体简图。(XL4的启动子系列缺失片段 来驱动LUC基因表达，由图中的deleted promoter来表示。Amp为氨节抗性筛选基因；luc+为 报告基因蛋火虫巧光素酶;MCS表示多克隆位点;箭头方向表示基因或启动子表达的方向。
[0027] 图 4:融合载体PGL3-C1、PGL3-C2、PGL3--C3、P化 3-C4、P化3-C5 的 Mlu 巧日趾 01 双酶 切鉴定图。Μ表示DL marker 2000，1-5分别表示融合载体961^3-(：1、961^3-〔2、961^3--〔3、 P化3-C4、p化3-巧的双酶切结果，上面较大的条带为载体条带，下端为缺失启动子条带，条 带长度分别为81化P、63化P、554bp、39化P、29化P。
[002引图5:由CCL4的系列缺失启动子驱动LUC基因在DT40细胞中的表达情况。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1:鸭的CCL4基因的启动子候选片段及相应缺失片段的获得
[0030] 在pre.ensembl.o巧数据库检索鸭(XL4基因全长序列。通过注释信息，找到其第一 外显子序列，选取第一外显子上游543bp的序列，在网站http://www.fruitf ly.org/cgi- bin/seq_tools/promoter . pi分析发现具有转录起始位点，在http ://www. cbrc . jp/ research/化/TFSEARCH.html上分析发现该序列具有大量转录因子识别位点。通过设计了 一对特异引物（引物命名为CCL4PF和CCL4PR，其序列见表1)，扩增了895bp序列，该序列包含 55化P 5'上游序列及14化P外显子序列和2(K)bp第一内含子。扩增的序列命名为CCL4P。扩增 片段检测结果如图2。
[0031] PCR反应体系为：2.0μll0XLATaqBuffer，化12mMdNTP，0.5μll0μM引物 CCL4PF和(XL4PR，1U LA Taq酶，0.5μ1 DNA，加去离子水补至SOyLPCR反应条件为:94°C预 变性 4min，35 个循环 94°C 变性 4〇3,54.6°(：退火4〇3,72°(：延伸1111111，72°(：延伸1〇111111。引物如 表1所示
[0032] 表1本发明设计的引物序列
[0033]
[0034] 表1说明：红色部分为酶切位点，(XL4pF 1-6为Mlul酶切位点，(XL4pRl为化〇1酶切 位点;加粗部分为保护性碱基。
[0035] PCR产物回收纯化:将扩增的PCR产物经1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min 后紫外灯下将目的条带(895bp)切下，放入1.5ml离屯、管中，然后经PCR产物纯化试剂盒(北 京百泰克生物技术有限公司，产品货号:DP1701)，按其说明书回收纯化PCR产物，将回收产 物保存至-20°C备用。
[0036] 回收产物连接:将回收产物按如下体系与载体pGEM-Teasy (购自普洛麦格(北京） 生物技术有限公司，即美国Promega公司）连接。连接体系为：2.5μ1 2 XLigbuffer，0 .化1 pGEM-Teasy vector,0. ?5