鸭bcl2l15基因在畜禽抗aiv病毒中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明设及抗病毒基因领域，具体地说，设及鸭BCL2L15基因在畜禽抗AIV病毒中 的应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是含有8个RNA基因组片段的负链RNA病毒。高致病性禽流感化ighly 化thogenic Avian Influenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的W禽 类为主的烈性传染病。自1878年意大利报道发生禽流感W来，册和H7两个亚型毒株持续在 世界各地的家鸡或火鸡中造成流感暴发，严重威胁养禽业的发展。近来研究表明，上世纪4 次世界性流感大流行中有3次，即1918年西班牙流感、1957年的甲2化2N2)亚型亚洲流感和 1968年的甲3化3N2)亚型香港流感，与禽流感病毒密切相关。运3次世界性流感大流行给人 类带来严重灾难，给社会造成动荡和巨大的经济损失。世界动物卫生组织(0IE)将禽流感 (AIV)列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。
[0003] 水禽包括家鸭是流感病毒的天然宿主，所有16种HA和9种NA的不同组合的亚型都 能在水禽中分离。流感病毒对水禽一直保持着低致病力的特征，水禽感染病毒并不发病，但 可W向外界排毒。某些对水禽致病力低的毒株，对鸡或其他宿主则表现为高致病性。然而， 随着流感病毒的不断进化，水禽与流感病毒的平衡状态被打破。如2002年首次报道在香港 出现致死水禽的册N1亚型毒株，2005年青海湖大规模爆发册N1亚型流感病毒致死候鸟事件 等。在人群中流行的新毒株出现有多种方式:禽流感病毒或其他流感病毒与人流感病毒发 生基因重排产生感染人的流行毒株、禽流感病毒在猪体内适应后产生的流行株、禽流感病 毒传播到人产生流行毒株W及人流感病毒老毒株时隔数年后又重新流行，此外，还有人流 感病毒本身的抗原漂移等。
[0004] 总之，A型流感病毒的最大特点是宿主广泛，亚型众多，变异形式多样，发病突然， 流行性、致病性强，易诱发严重并发症，危害巨大。因此，科学家们在研究流感病毒的变异、 进化、流行与分布规律，提高防控流感能力的同时，也致力于鉴定新的抗流感病毒的免疫基 因，解析宿主影响流感病毒感染性、致病力W及免疫应答的分子机理研究，W提高宿主的抗 病性能及促进防控流感病毒新手段的开发。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供鸭BCL2L15基因在畜禽抗 AIV病毒中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了B化2L15基因在影响病毒复制中的应用，所述B化2L15基因为SEQ ID NO.1所示的核巧酸序列或SEQ ID No.1所示核巧酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个 核巧酸所获得的具有同等功能的由SEQ ID No.1衍生的核巧酸序列。其表达的蛋白质的氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 具体地说，所述应用包括通过BCL2L15基因在细胞中的过表达来抑制病毒在细胞 中的复制，W及在敲除BCL2L15的细胞中病毒的复制显著增加。
[0009] 所述病毒可为AIV、NDV、IBDV等。
[0010] 作为优选，所述病毒为禽流感病毒。B化化15基因在感染禽流感病毒的细胞中过表 达，能够显著抑制禽流感病毒的复制。
[0011] 进一步地，本发明还提供BCL2L15基因在抗AIV病毒中的应用。需要说明的是，本发 明请求保护所述基因在抗AIV病毒中的应用，由于抗AIV病毒并不等同于治疗禽流感，抑制 AIV病毒的复制也并不等同于感染AIV病毒的动物能够被治愈，因此，本发明请求保护的技 术方案不设及疾病的诊断和治疗方法。
[0012] 更为具体地，本发明提供一种具体的方法，将BCL2L15基因的CDS序列构建到能够 高效表达外源基因的载体中，得到重组载体，并将重组载体导入禽类DF1细胞中。
[0013] 作为优选，所述载体为含有强启动子的真核表达载体，W实现BCL2L15基因的过表 达。
[0014] 更为优选的，为了更好的实现BCL2L15基因的过表达，其核巧酸序列如SEQ ID NO.3所示。该载体通过CAG启动子启动目的基因在真核细胞里高表达，并具有独立的GFP和 Neo双筛选标记，利用转座子系统高效整合细胞基因组中。
[0015] 利用上述载体构建重组载体时，将BCL2L15基因的CDS序列插入到SEQ ID NO.3所 示序列的2828bp处。
[0016] 本发明还提供一种含有BCL2L15基因的转基因细胞。
[0017] 作为优选，所述转基因细胞为鸡胚成纤维永生化细胞系DF1。
[0018] 本发明还提供了一种工具细胞，所述工具细胞为过表达BCL2L15基因的细胞。所述 细胞不具有全能分化的功能。
[0019] 本发明还提供了一种用于疫苗生产的工具细胞，所述工具细胞为敲除了 BCL2L15 基因的细胞。所述细胞不具有全能分化的功能。
[0020] 本发明还提供了一种转基因动物的构建方法，所述方法包括在动物体内转入本发 明所述的鸭B化2L15基因。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 现有技术仅公开了 BCL2L15基因参与细胞调亡过程，与细胞转化和胃肠道肿瘤的 发生相关。而本发明提供了利用BCL2L15基因制备抗AIV等病毒转基因动物的理论依据。
[0023] 本发明根据转录组数据结果分析得到B化2L15基因 mRNA测序片段，分别在两株 册 N1 毒株（A/duck/Hubei/49/05，DK/49,高致病）和（A/goose/Hubei/65/05，GS/65,低致 病），感染4周龄绍兴鸭后的第1、第2和第3天脾脏、肺和脑组织中的表达显著增高(见图1)， 证实了鸭BCL2L15基因是抵抗流感病毒的重要候选基因。
[0024] 本发明提供了一个与抗禽流感相关的新基因 BCL2L15,并首次利用分子生物学结 合细胞生物学实验的方法，证明了 BCL2L15具有抑制AIV病毒复制的作用。
[0025] 本发明所述BCL2L15基因可用于制备抗流感病毒的转基因动物，此外，敲除 B化化15基因的细胞系可W作为AIV等病毒疫苗生产的工具细胞。
[0026] 本发明所提供的BCL2L15基因可用于抑制流感病毒，特别是可W显著抑制AIV病毒 的复制，因此可W针对鸭BCL2L15基因进行深入的功能研究，从而确定其抗AIV病毒的关键 蛋白结构域或氨基酸。利用转基因技术等基因编辑方法，获得可诱导性高表达BCL2L15基因 的转基因畜禽，培育出抗AIV等多种类型病毒的转基因农业动物优良品种。
【附图说明】
[0027]图1为本发明利用转录组数据分析得到的鸭BCL2L15基因 mRNA序列，分别在两株 册 N1 毒株（A/duck/Hubei/49/05，DK/49,高致病）和（A/goose/Hubei/65/05，GS/65,低致 病），感染4周龄绍兴鸭后的第1、第2和第3天脾脏、肺和脑组织中的表达模式;横坐标代表时 间点，纵坐标代表相对表达量。
[002引图2为本发明实施例2中所述载体PiggyBac的图谱，其中X gene为B化2L15。
[0029] 图3为本发明实施例2中瞬时转染BCL2L15W及阴性对照质粒24h后DF1细胞的镜下 观察结果。
[0030] 图4为本发明实施例2中瞬时转染BCL2L15W及阴性对照质粒4她后，收取细胞总蛋 白后对B化2L15基因的过表达效果的Western blot验证。实验处理组依次为过表达B化2L15 组(0E)、阴性对照组（Mock)，WGAPDH基因作为内参。
[0031] 图5为本发明实施例3中在DF1细胞中过表达B化化15基因，抑制实施例6中流感病 毒DK/49(左)和GS/65(右）的复制，横坐标表示感染后收取细胞上清液的时间点，纵坐标表 示EID50的对数值。
[0032] 图6为本发明实施例3中DF1细胞感染流感病毒AIV(DK/49)4她后，内源B化2L15基 因 mRNA的表达变化，WGAPDH基因作为内参。
[0033] 图7为本发明实施例3中细胞过表达B化2L15基因前后，感染流感病毒AIV(DK/49) 后，病毒不同形式RNA的相对表达变化，WGAPDH基因作为内参。
【具体实施方式】
[0034] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 本实施例实验操作中包含：
[0038] 1)总RNA的提取及反转录反应
[0039] 组织或细胞总RNA的提取利用Invi化ogen公司生产的化izol试剂，并严格按照产 品说明书进行操作;反转录反应采用的是Promega公司的MMLV逆转录酶试剂，并严格按照说 明书进行操作。
[0040] 2)基因克隆及载体构建
[0041] W反转录得到的cDNA为模板，利用特异引物进行PCR扩增。产物经胶回收纯化后连 接到祀asy-Blunting simple载体上，挑取单克隆菌落，测序鉴定正确后提取质粒。质粒双 酶切后，利用T4连接酶将目的基因连接到相应的载体上。
[0042] 3)细胞培养及转染
[0043] 鸡胚成纤维细胞系(DF1)由本实验室前期所冻存。细胞复苏培养严格无菌操