一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种表达、分离纯化人源Fn3展示抗原脑钠肽前体N端(NT-proBNP)线性表位的方法，可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，即脑钠肽前体抗原替代物。为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。
【背景技术】
[0002]在ELISA检测试剂盒制备过程中，需要相应的抗原作为标准品。其中，蛋白质类抗原占有很大的比例。如何高效生产蛋白质类抗原蛋白，是该类产品的一个技术关键。本发明采用人源骨架蛋白Fn3展示蛋白质类抗原线性表位，尝试建立一个利用大肠杆菌高效生产蛋白质类线性表位的通用的平台。
[0003]骨架蛋白是一类构成蛋白质骨架部分的能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。来源于一些蛋白质结构非常稳定的结构域。该类蛋白具有高度稳定性和可溶性，易于在大肠杆菌种高水平表达。其中研究非常深入的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)是一种骨架蛋白。Fn3包含94个氨基酸残基，分子量13.8kD，不含半胱氨酸和二硫键，由四条β-折叠和一条α-螺旋组成。Fn3具有非常高的热稳定性，Tm值高达87 0C，其热变性过程完全可逆。除此之外，Fn3能够耐受高浓度的尿素;且在室温条件下，PH值在2-11.3的范围内仍然能保持蛋白质的天然构象。这个蛋白非常适合作为融合蛋白在大肠杆菌种表达纯化。
[0004]抗原表位(antigenic epitope)，简称“表位”，也称为“抗原决定簇”(antigenicdeterminant)，是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。抗原表位可被免疫系统(尤其是抗体、B细胞或者T细胞)所识别。抗体中能识别抗原表位的区域叫做“互补位”或“抗体决定簇”。通常抗原表位是指外来蛋白质等物质的其中一部分序列。蛋白质抗原的表位根据它们的结构以及与互补位的交互作用，被分为构象表位和线性表位这两种类型。其中线性表位是由一段连续的抗原氨基酸序列构成，与抗原的结合作用的基础是其一级结构，是蛋白质抗原性的基础，抗体的特异性是针对表位的。由于表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成，合成单独的抗原表位肽由于其分子较小，极难表达纯化。
[0005]本发明采用人源骨架蛋白Fn3展示脑钠肽前体抗原表位，通过该途径解决一些抗原在大肠杆菌种表达困难或抗原不稳定的问题，实现只表达骨架蛋白所展示抗原的一个或多个表位，就可以生产具有和抗原蛋白具有等效的高稳定的抗原蛋白替代物。
【发明内容】
[0006]本发明建立基于人源Fn3展示抗原脑钠肽前体N端(NT-proBNP)线性表位来制备脑钠肽前体抗原替代物的方法，可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，即脑钠肽前体抗原替代物。为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。
[0007]选取编码能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，利用大肠杆菌表达系统制备和脑钠肽前体N端(NT-proBNP)的抗原性相当的融合蛋白。
[0008]一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物方法，包括以下步骤:
[0009 ] 1、骨架蛋白Fn3展示NT-proBNP线性表位重组蛋白表达载体构建:
[0010](I)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计展示表位位置。根据模建结果，将NT-proBNP线性表位设计在Fn3骨架蛋白的FG区，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT-proBNP线性表位融合基因，合成Fn3展示NT-proBNP线性表位的基因片段，在融合基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化:采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因，在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT-proBNP编码表位的短肽序列CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，以上设计合成的基因编码Fn3展示NT-proBNP 线性表位重组蛋白 ，命名为 Fn3-epitope。
[0011](2)将以上融合基因构建到大肠杆菌胞内表达载体上，融合的重组蛋白将在大肠杆菌胞内表达:将上述设计合成的基因，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a( + )上，得到重组载体 pET28-Fn3_epitope。
[0012]2、将构建的重组蛋白基因质胞内表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有线性抗原表位。将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达3-6小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素。
[0013]将构建的表达载体电击转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，然后将转化子接种到10毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以I: 100接种到500毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37 °C培养，直至OD6qq达到0.6。然后，在25-35 °C、200rpm条件下添加I毫摩尔的的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白IB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L。
[0014]3、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有线性抗原表位的融合蛋白:用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白Fn3-epitope0
[0015]本发明所述的抗原表位展示方法还具有广泛的潜在应用领域，如可用于展示某抗原分子上的某一表位，这种展示有外源抗原表位的重组蛋白，可作为某抗原的替代物直接用于免疫动物，制备针对该表位的抗体，如果制备的抗体能特异性识别相应的抗原，则通过这种技术就实现了在无相应抗原的情况下制备了该抗原的抗体。本发明所述的抗原表位展示方法也可用于蛋白质表位疫苗的制备。例如，利用该表位展示方法展示病原微生物或肿瘤抗原的中和性抗原表位，这种展示有中和性抗原表位的重组蛋白可直接作为疫苗，用于免疫动物，让动物产生针对中和性表位的抗体，从而在体内清除相应的病原微生物或抑制肿瘤的生长。
[0016]本发明的有益效果是，可以简单、快速、高效表达具有和脑钠肽前体N端的抗原性相当的融合蛋白。为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。
【附图说明】
[0017]图1是本发明的Fn3_epitope基因结构图；
[0018]图2是本发明的pET28-Fn3-epitope的载体结构图；
[0019]图3是本发明的重组Fn3_epitope蛋白分离纯化图，其中:1、2、3分别是实施例分离纯化的Fn3-epitope重组蛋白，Μ.标准蛋白质；
[0020]图4重组Fn3-epitope蛋白与鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力分析。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。
[0022]实施例一
[0023]1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527) ο在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT-proBNP编码表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码 NT-proBNP 的 12-21 氨基酸残基LETSGLQEQR)，融合基因结构见图1。
[0024]将序列表[001]所示的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)与NT-proBNP融合基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a (+)上，得到重组载体pET28-Fn3_ep i tope，载体结构见图2。
[0025]2、将构建的表达载体电击转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到10毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到500毫升含有Kan(50微克每毫升)LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37°C培养，直至OD6qq达到0.6。然后，在25°C、200rpm条件下添加I毫摩尔的的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白。LB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L。
[0026]3、通过常规方法制备可溶蛋白，用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白Fn3_epitope 如图 3所示。
[0027]4、将步骤3获得的重组蛋白Fn3-epit0pe通过ELISA方法测定免疫血清的效价。重组Fn3_epi tope蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液后封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:2500稀释)，用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(I: 4000)，底物为TM