基于AllGlo探针的CYP2C19*2检测分型试剂盒及其分型方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及单核巧酸多态性(SNP)，尤其是设及一种基于AllGlo探针的CYP2C19*2 检测分型试剂盒及其分型方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性（single nucleotide polymor曲ism,SNP),主要是指在基因组水 平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。作为第Ξ代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感 性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试W及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
[0003] 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的祀点定位于某个基因，甚 至是单个核巧酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可W通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基 因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据运一特点选择治疗 效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
[0004] SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、化gman巧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨烙解曲线分析法化RM)等。其 中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪W及电泳仪器即 可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman巧光探针法准确 度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位 点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难W实 现高通量、自动化;高分辨烙解曲线分析法化IM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不 足，仪器选择少。
[0006] AllGlo探针作为新一代的巧光探针，在具备化qMan-MGB探针优点的基础上，大大 提高信噪比，减少背景巧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测瘤疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突变巧611邑，2.1.￥11,乂.￥.1^11,2.]\1.66]1邑，0.￥.211日]1邑，1^.化6]1,5.]\1?日口1(1 detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412( 11-12) :1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病(Wu，D.S. aienJ.Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 氯化格雷(波立维)是目前世界范围内使用最广泛的嚷吩化晚类抗血小板药，用于 急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠屯、病的一级二级预防，可W减少屯、血管疾病患者屯、脏病 发作、卒中W及死亡的风险。近年来的研究发现，氯化格雷体内生物学功能的实现与细胞色 素酶P450 2C19(CYP2C19)有重要的联系化azui M，NisMya YJsMz址a T，Hag化ara K, Farid ΝΑ,et al.(2010)Identification of the human cytochrome P450enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite.Drug Metab Dispos 38:92_99)〇CYP2C19*2 是CYP2C19基因的一个SNP位点，在外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异 常剪接点，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，蛋白合成过早被终止，丧失蛋白催化 活性，进而降低氯化格雷的药用效能。2010年美国食品药品监督管理局(FDA)曾发出警示， CYP2C19*2基因携带者不能有效将氯化格雷转化为活性产物，故不能像CYP2C19*1基因携带 者一样从氯化格雷抗血小板的作用中获益。因此服用氯化格雷的患者需先进行CYP2C19*2 检测分型（Administration.FaD.FDA Drug Safety Communication:Reduced effectiveness of Plavix(clopidogrel)in patients who are poor metabolizers of the drug.:U.S.Food and Drug Administration；2010[cited 201INovlT];[4screen] .Available from: http : //www . fda . gov/Drugs/DrugSaf ety/)。用药前对患者进行 CYP2C19巧的检测分型，能够为患者选择最佳的治疗用药，提供合适的治疗剂量，为临床用 药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，CYP2C19*2与药物代谢的 紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方 法来满足精准医学的发展。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探针的CYP2C19巧检测分型试剂盒。
[0009] 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的CYP2C19巧检测分型方法。
[0010] 所述基于AllGlo探针CYP2C19*2检测分型试剂盒，包括实时巧光定量PCR试剂、阳 性对照及阴性对照；
[0011]所述CYP2C19*2为美国国家生物技术信息中屯、（NCBI)所提供人10号染色体 CYP2C19基因中的SNP位点。
[001 ^ 所述实时巧光定量PCR试剂包括W下组份：10 X Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、加 /μ L的Taq Hotstad DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLOW ROXaOOmL无核酶水、10μ mol/L CYP2C19*2的特异正向引物、10ymol/L CYP2C19巧的特异反向引物和AllGlo探针;所 述lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[OOU]所述CYP2C19*2的特异正向引物的核巧酸序列为：
[0014] SEQ ID NO.1:5'-TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG-3';
[0015] 所述CYP2C19巧的特异反向引物的核巧酸序列为：
[0016] 沈Q ID N0.2:5'-AATAAAGTCCCGAGGGTTGTTG-3'。
[0017] 所述AllGlo探针为CYP2C19巧的特异探针，其核巧酸序列为：
[001 引 沈Q ID N0.3:CYP2C19*2-G:MAR-TATTTCCCGGGAACC-MAR;
[0019] 沈Q ID N0.4:CYP2C19*2-A:JUP-TTATTTCCCAGGAACC-JUP。
[0020] 所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品；所述 阳性纯合对照品1为CYP2C19*2分型为GG的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为CYP2C19巧分 型为AA的DNA样品，所述阳性杂合对照品为CYP2C19巧分型为GA的DNA样品。
[0021] 所述阴性对照为ImL的无核酶水。
[0022] 所述基于AllGlo探针的CYP2C19巧检测分型方法，包括W下步骤：
[0023] 1)采用常规方法提取邸TA抗凝全血样本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探针的CYP2C19*2检测分型试剂盒提供的实时巧光定量 PCR试剂将DNA进行实时巧光定量PCR扩增；
[0025] 3)根据检测到的巧光信号对人CYP2C19基因单核巧酸多态性位点CYP2C19*2进行 分型。
[00%] 所述AllGlo探针可采用美国AlleLogic Biosciences Co巧oration公司的巧光定 量探针，它拥有普通化qman，化qman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克 服了目前运几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端泽灭基团的限 审ij，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制巧 光染料，标记在寡核巧酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可W提高Tm 值(退火溫度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团，提高巧光增量。
[0027] 所述AllGlo探针具有W下优势：
[002引①提高Tm值(可达10°CW上），探针更短可W达到15~16个碱基，可W适用A，T含量 比较高的序列设计探针；
[0029] ②加大了多重巧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是泽灭基团，打破 传统化qman探针因波长原因标记选择困难，不受泽灭基团波长限制；
[0030] ③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的泽灭效果；
[0031 ]④成本较低，价格仅相当于Taqman-M