一组用于猪源性实时荧光pcr检测的特异性引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体设及一组用于猪源性实时巧光PCR检测的特 异性引物和探针。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，人们越来越关屯、食品的真伪性，食 品中动物及植物源性成分鉴别成为社会关注的焦点之一，消费者对肉制品和油类质量与安 全性的要求越来越高。目前个别食品行业充斥着渗假行为，特备是在利益驱动下，将低成本 的猪肉渗入到高成本的牛羊肉中更是一些不法商贩惯用的手段，也有不少不法商家将地沟 油按一定比例添加到新鲜使用的植物油中，谋取暴利，危害消费者健康。因此，建立一种可 靠的方法鉴别植物油和牛羊肉中猪源性渗假成分具有重要的实际意义和社会意义。
[0003] 过去用于肉食和油类中物种的鉴别主要依赖于电泳法，免疫法，ELISA等蛋白质分 析法。运些技术对于加工混合肉制品中的猪源性成分却无法分析出，而PCR技术基于其反应 时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术 在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可W精确地辨别物种并 实现快速、大容量的实时定量检测，而新兴的实时巧光定量PCR技术可W很好的满足要求， 正广泛的应用于食品和油脂类猪源性成分的检测。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于设计一组猪源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于 植物油和肉食中猪源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的巧光定量PCR检测的方法。本发 明采用基因克隆技术，将猪源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体PMD18-T中，获得 含有cytb基因片段的重组质粒，W此作为标准品。根据猪源性cytb的基因片段编码基因序 列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立W实时巧光定量聚合酶链反 应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一组用于猪源性实时巧光PCR检测的特异性引物和探 针，所述特异性引物和探针的核巧酸序列为(1)或(2)中的一种： (1) 、上游引物：5 ' -ACGATTCTTCGCCTTTCACT-3 ' 下游引物：5 ' -GGGGTGTAGTTGTCTGGGTC-3 ' 探针：5 ' -ATTACCGCCCTCGCAGCCGTACA-3 ' 所述引物和探针扩增的目标核巧酸序列为序列表中SEQ ID No.3; (2) 、与（1)所述序列互补的序列。
[0006] 作为优选，所述探针的5'端巧光报告基团是FAM，3'端标记的是巧光泽灭基团 TAMRAo
[0007] 本发明的第二个目的是提供猪源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为猪源性的定 性或定量检测试剂盒;所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针； 作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为:将猪源性保 守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有猪源性保守 基因片段的重组质粒，W此作为标准品；所述猪源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No. 2； 作为进一步优选，所述猪源性保守基因片段是W序列表中SEQ ID No. 1的核巧酸序列 为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的： 上游引物:5'- TACGGTCATCACAAATCTACTATC -3' 下游引物：5'- ATATTATGCTTCGTTGTTTGG -3'； 作为优选，所述PCR扩增的条件为:94°C预变性5min;94°C 30s、55°C 30s、72°C30s，35 个循环；72°C lOmin。
[0008] 本发明的第Ξ个目的是提供特异性引物和探针在制备定性或定量检测猪源性的 试剂盒中的应用。
[0009] 作为优选，所述应用是分别W标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探 针进行实时巧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
[0010] 作为优选，所述实时巧光定量PCR的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、 60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0011] 本发明的第四个目的是提供猪源性的实时巧光定量PCR检测方法，所述检测方法 不W有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下： (1) 制备标准品：将猪源性保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆菌中进 行诱导表达，获得含有猪源性保守基因片段的重组质粒，W此作为标准品;所述猪源性保守 基因片段为序列表中SEQ ID No.2; (2) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时巧光PCR扩增； (3) 标准曲线绘制； (4) 通过标准曲线和待测样品的Ct值进行猪源性的快速定量检测。
[0012] 作为优选，步骤(1)中所述猪源性保守基因片段是通过W下引物扩增得到的： 上游引物为5 ' -TACGGTCATCACAAATCTACTATC -3 ' ； 下游引物为5 '-ATATTATGCTTCGTTGTTTGG -3 ' ； 作为优选，PCR扩增所述猪源性保守基因片段的条件为:94°C预变性5min; 94°C 30s、55 1：3〇3、721：3〇3,35个循环；72°(：1〇111111; 作为优选，步骤(2)中所述引物和探针的用量均为1.化1; 作为优选，步骤(2)中所述实时巧光PCR扩增的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0013] 本发明的第五个目的是提供猪源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不W有生 命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下： (1) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时巧光PCR扩增； (2) 通过待测样品的Ct值对猪源性进行定性检测：当Ct值小于3別寸，为阳性;否则，为阴 性； 作为优选，步骤(1)中所述引物和探针的用量均为1.化1; 作为优选，步骤（1)中所述实时巧光PCR扩增的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0014] 本发明提供用于对猪源性进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样 品的DNA结合实时巧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测肉制品和植物油脂中猪源性 含量的目的。本发明所提供的引物和探针可对待测肉制品和植物油脂中猪源性含量进行定 性、定量分析，对判断肉制品和植物油脂中猪源性含量具有重要意义，本发明将在食品检测 领域发挥重要作用。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为引物和探针体系优化实验结果;其中，a代表引物为1.化1，探针为1.化l;b代表引 物为1.化1，探针为1.6μ1; C代表引物为1.化1，探针为0.祉1; d代表引物为2.化1，探针为0.8 l·U;e代表引物为l.化l，探针为0.祉l;f代表引物为2.化l，探针为1.0μl;g代表引物为l.化 1，探针为0.祉1 ;h代表引物为1.化1，探针为1.化1; i代表引物为2.化1，探针为1.化1; 图2为灵敏度实验结果;其中，a代表质粒浓度为1.00 X 108copies/ml、b代表质粒浓度 为1.00 X l〇7copies/ml、c代表质粒浓度为1.00 X l〇6copies/ml、d代表质粒浓度为1.00 X l〇5copies/ml、e代表质粒浓度为 1.00 X l〇4copies/ml、f代表质粒浓度为 1.00 X l〇3copies/ ml、g代表质粒浓度为1.00 X 102copies/ml，h代表阴性对照； 图3为特异性实验结果;其中出现标准扩增曲线的为猪，未出现标准扩增曲线的为牛、 羊、狗、鱼、鸡、鸭、碟、兔、驴、蛙、鼠、阴性对照； 图4为猪源性标准曲线。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。W下的实施例便于更好地 理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。 [0017]实施例1 cy忧基因标准品的制备 要建立实时巧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高 度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。动物线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热 稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特 点，其中线粒体细胞色素 b(cytb)基因序列最为保守型。cytb基因检测猪源性，有较高的敏 感性和特异性。本申请主要采用PCR技术扩增猪源性cytb基因，利用基因重组技术将其连接 到质粒载体PMD18-T中，构建出重组质粒PMD18-T- pig巧tb，并进行相应的PCR鉴定和测序 鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
[001引一、模板DNA的制备 提取猪肝脏组织基因组DNA，用作cytb基因 PCR扩增的模板，提取基因组DNA的试剂盒为 细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离屯、柱型），采购自百泰克生物技术有限公司； (1)取1.5g新鲜猪肝脏组织用液氮研磨成粉末，加到5ml离屯、管中，加入4ml SE缓冲液， 混匀，4500 r/mim离屯、15min; (2) 吸取上清，4°C 12000 r/min离屯、20min，弃上清，收集沉淀； (3) 加入40化1 Buffer Digestion,震荡混匀。65°C水浴1-化至细胞完全裂解（注意： 1、水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。 如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或 导致提取的DNA不纯。2、如需得到无 RNA的DNA，