用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及肺癌检测技术领域，具体设及用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针 及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌发生于支气管黏膜上皮，近几年肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势，已 成为21世纪全球面临的严峻的健康问题。在中国，预计到2025年，肺癌患者将达到100万，居 世界第1位。研究肺癌的发生、发展及治疗和预后的相关问题一直W来都是医学界面临的重 要课题。目前对肺癌的早期诊断有胸部X线和胸部CT检查、疲细胞检查、纤维支气管镜检查 和经皮肺穿刺活检等检查方法，由于运些临床诊断方法诊断肺癌成本较高且具有仪器的特 殊性和技术限制W及检测时对患者的创伤等原因，使运些诊断方法有很多局限性，得不到 广泛的应用，几乎2/^3的肺癌患者在就诊时已是晚期（虹期或1￥期），错过了最佳治疗时期。
[0003] 目前关于肺癌标志物的研究也比较多，但多集中在肺癌组织及血液中的游离 micro RNA，尚未发展到临床诊断阶段。
[0004] 组织中肺癌标志物的检测需要手术或活检取得癌症组织，不适用于肺癌的早期检 查或多次检查，因为一旦需要活检或手术，肺癌已经处于比较晚期，肺癌标志物诊断已无必 要性。
[0005] 所W找到一种新的肺癌检测标志物并发展成为可供临床检测且简单实用的技术， 辅助肺癌患者临床诊断，提高肺癌的诊断准确率，对肺癌的早发现早治疗具有重大的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是现有的组织中肺癌标志物检测需要手术或者活检，不 适用于肺癌早期检查或多次检查，增加病人痛苦;血液标志物的诊断技术多停留在研究阶 段，检测效果还有待进一步证实，尚未发展到临床诊断阶段。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了用于检测肺癌早期的基因标志物，其为Ξ种 基因的联合标志物，具体包括SFTPB基因、FGFR1基因和FILIP1L基因。通过对Ξ个基因 SFTPB、FGFR1和FILIP1L血液中表达量的测定，达到肺癌的早期诊断(肺癌已经发生，但人体 基本没有症状），辅助提高临床肺癌的检出率，降低肺癌患者的死亡率。
[000引 SFTPB、FGFR1和FILIP1L分别在不同的研究中发现其与肺癌相关。其中SFTTB是一 种亲表面活性蛋白，蛋白质组学研究表明SFTPB的血浆水平与肺癌的临床已知独立的危险 因素相关，是非小细胞肺癌一种很有前途的血液标记物。此外，SFTPB与早期肺癌有关，提示 在早期潜在非小细胞肺癌的肿瘤是否适合于手术切除。FGFR1是一种成纤维细胞生长因子 受体，它的表达可W减少细胞调亡，促进癌细胞的存活，是早期鱗状细胞肺癌的一个独立的 不良预后标物。FILIP1L是一种细丝蛋白，可W通过抑制基质金属蛋白酶的表达，从而抑制 癌细胞的侵袭和转移，在肺癌组织中FILIP1L蛋白和调控FILIP1L蛋白的mRNA表达水平低于 正常组织。目前的研究仅停留于SFTPB、FGFR1和FILIP1L蛋白的含量与肺癌不同分型的相关 性。本研究通过大量的前期研究，筛选得到血液单核细胞中SFTPB、FGFR1和FILIPIL基因表 达与肺癌显著相关，并且可用于辅助肺癌的早期诊断，Ξ个基因标志物整合后，其对早期肺 癌的诊断准确率可达到98.3%，且适用于不同分型肺癌的诊断。
[0009] 本发明提供的用于检测肺癌的引物和探针，包括SFTPB引物探针组、FGFR1引物探 针组和FILIP1L引物探针组，核巧酸序列如下：
[0010] SFTPB引物探针组：
[0011] 上游引物:SEQ ID N0:l(5'-CAGAAACTACAGACAAAGAGAGTGGAA-3'），
[0012] 下游引物：SEQ ID N0:2(5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATCT-3'），
[0013] 探针：SEQ ID N0:3(5'-CAGGCCTCTGAGCCCAAGCTAAGCC-3'）；
[0014] FGFRl引物探针组：
[0015] 上游引物：SEQ ID N0:4(5'-CACGGGACATTCACCACATC-3'），
[0016] 下游引物：SEQ ID N0:5(5'-ACCCCGAAAGACCACACATC-3'），
[0017] 探针：SEQ ID N0:6(5'-ACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGC-3'）；
[001引 FILIPIL引物探针组：
[0019] 上游引物：SEQ ID N0:7(5'-CATCCCTGAAACACCTTGATTTTAT-3'），
[0020] 下游引物：SEQ ID N0:8(5'-TCAAGGCTTAAAACAACATCCATTT-3'），
[0021] 探针：SEQ ID N0:9(5'-AAGCCACGCTGTATCTGGACTTCTGATCTG-3'）；
[0022] 其中，探针的核巧酸序列5'端标记巧光报告基团，3'端标记巧光泽灭基团。
[0023] 优选地，所述巧光报告基团为FAM，巧光泽灭基团为TAMRA。
[0024] 本发明提供的一种肺癌检测试剂盒，包括W上所述的用于检测肺癌的引物和探 针。为方便巧光定量PCR检测，试剂盒中优选还包括化qman反应缓冲液、dNTPs、Mgh等。
[002引优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括内参基因 GAPDH的检测引物和探针，其具体 核巧酸序列为上游引物:SEQ ID NO: 10,下游引物沈Q ID NO: 11，探针:SEQ ID NO: 12;探针 的核甘酸序列5'端标记巧光报告基团，3'端标记巧光泽灭基团。巧光报告基团优选FAM，巧 光泽灭基团优选TAMRA。
[0026] SEQ ID N0:10(5'-GCATCCTGGGCTACACTGAG-3'）；
[0027] 沈Q ID N0:ll(5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，）；
[0028] 沈Q ID N0:12(5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCC-3'）。
[0029] 优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括阳性对照品，阳性对照品包括梯度浓度的 SFTPB基因、FGFR1基因、FILIPIL基因 W及GAPDH基因。
[0030] 优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括駐qMan猿.Universal PCR Master Mix和 RNase-free water。运两种试剂均为市售商品。
[0031] 本发明还提供了 W上任一所述的肺癌检测试剂盒的使用方法，包括W下步骤：
[0032] (1)提取样本总RNA，逆转录合成cDNA;
[0033] (2) WcDNA为模板，分别使用权利要求2所述的用于检测肺癌的引物和探针进行巧 光定量PCR反应，收集巧光信号，获取FGFR1基因、SFTPB基因和FILIPIL基因的表达量；当试 剂盒中含有内参基因时，使用内参基因 GAPDH的检测引物和探针进行巧光定量PCR反应， GAPDH基因的PCR反应结果用于对Ξ个目的基因的测定结果进行归一化，校正由起始取样量 导致的Ct值差异；
[0034] (3)计算联合预测因子:联合预测因子的表达式为:7 = 1.77^+3.6扣2-义3，其中7 表示联合预测因子，XI表示样本FGFR1基因用内参基因归一化后的相对表达量，x2表示样本 SFTPB基因用内参基因归一化后的相对表达量，x3表示样本FILIP1L基因用内参基因归一化 后的相对表达量；当y>34.44,该样本判定为肺癌阳性；当y<34.44,该样本判定为肺癌阴 性，即正常样本。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0036] 本发明通过研究发现肺癌患者血液单核细胞中SFTPB、FGFR1和FILIP1L mRNA表达 异常，其整合后对肺癌的诊断准确率达到98.3 %，其诊断的特异性和灵敏度也远远优于单 个基因。
[0037] 并且，该试剂盒的测定样本为外周血中单核细胞，取材方便，创伤小，安全;采用 RT-PCR技术进行Ξ个祀基因的定量测定，具有特异性和灵敏度高、操作简单及易于大通量 筛查的优点。
[0038] 本发明可广泛运用于肺癌患者SFTPB、FGFR1和FILIP1L基因扩增水平的检测，可用 于肺癌的早期诊断和疗效评价，提高病理检测的可重复性和准确性，避免过度组织活检，更 准确的筛查出的肺癌患者，早期治疗干预，可W大大地降低医疗成本和费用，减少医疗资源 的浪费，延长部分患者生存期，提高患者生存质量。
【附图说明】
[0039] 图1是SFTPB、FGFR1和FILIP1LS个祀基因在正常对照和患者样本中Act的变化。 注:*表示与正常相比，P<〇.〇5。
[0040] 图2是SFTPB、FGFR1和FILIP1LS个祀基因的ROC曲线分析结果。
[0041 ] 图3是SFTPB、FGFR1和FILIP1LS个祀基因整合后R0C曲线分析结果。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，W使本领域的技术人员可W更好的 理解本发明并能予W实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0043] 实施例1用于检测肺癌的试剂盒的制备及使用
[0044] 1、检测SFTPB、FGFR1和FILIP1L基因表达水平的实时巧光定量PCR试剂盒组成：
[0045] SFWB基因特异性引物(上下游引物预混），ΙΟμΜ;特异巧光探针，2μΜ;
[0046] FGFR1基因特异性引物化下游引物预混），10μΜ;特异巧光探针，2μΜ;
[0047] FILIP1L基因特异性引物(上下游引物预混），10μΜ;特异巧光探针，2μΜ;
[004引GAP畑基因特异性引物化下游引物预混），ΙΟμΜ;特异巧光探针，2μΜ;
[0049] 'TaqM姐l@Universal PCR Master Mix,购自ΑΒΙ公司；
[0050] RNase-free water,购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0051] 阳性对照品分别单独保存，使用时进行浓度梯度稀释。
[0052] 2、试剂盒的使用方法：
[0053] (1)实时巧光定量PCR反应体系
[0054] 表1实时巧光定量PCR反应体系
[ο化5]
[0056] 注:上述反应试剂采用美国ΑΒΙ公司化qman巧光定量试剂盒，也可用其他公司同类 型产品。
[0057] PCR 的扩增条件为:95°C 预变性 10min，95°C 变性 1〇3,60。(：退火3〇3,72。(：扩增3〇3， 进行45个循环。
[0化引（2)数据处理
[0059] 本试剂盒采用相对定量法进行数据分析。通过检测样本3个祀基因和1个内参基因 的Ct值，通过法分析癌样本相对正常样本的表达水平的差异。sftpb、FGFR1和FILIP1L 基因表达水平采用其与内参基因 GAPDH扩增Ct值的差值Act表示。Act的大小与SFTPB、 FGFR1和FILIP1L基因的含量负相关。相较于正常组，如果肺癌患者SFTPB基因的Act值减 小，即意味着在肺癌患者组，SFTPB基因的表达量增加