一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体设及猪伪狂犬病毒的亚单位疫苗及其制备方 法，W及用于制备预防和/或治疗与猪伪狂犬病毒相关疾病和由猪伪狂犬病毒导致的感染 的组合物的应用。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由瘤疹病毒科化erpesviridae) a亚科中的猪 瘤疹病毒I型（Suid he巧esvirus Istrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生 动物的一种W发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪的伪狂犬病 在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流 产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻搏，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜 性及潜伏感染特性，在外周神经系统可W长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力 的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 本领域存在表达量高、有效免疫的抗伪狂犬病病毒感染的亚单位疫苗的现实需 要。
【发明内容】
[0004] 本发明首次通过将猪伪狂犬病毒浊蛋白取其片段进行融合表达，制备亚单位疫 苗，针对猪伪狂犬病毒引起的伪狂犬病有着较好的保护作用，而且意外发现，制备的浊蛋 白片段表达量显著提高，大大降低了免疫成本。
[0005] 本发明的设及一种猪伪狂犬病病毒浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片 段，其中，所述浊蛋白片段能保持与所述浊蛋白的抗原活性；所述变异体或其活性片段的 氨基酸序列中与所述浊蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或多个保守性氨基酸替换、 添加或删除而仍能保持与所述浊蛋白片段的抗原活性。
[0006] 本发明的另一方面设及编码本发明所述猪伪狂犬病病毒浊蛋白片段、或其保守 性变异体或其活性片段的核巧酸序列。 阳007] 本发明的又一方面设及一种猪伪狂犬病病毒浊-曲蛋白，其中，所述浊-曲蛋白包 括本发明的所述的浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段W及曲蛋白。
[0008] 本发明的再一方面设及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗 包含免疫量的本发明的所述浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段和药学上可接 受的载体。
[0009] 本发明还设及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫 量的本发明的所述浊-曲蛋白片段和药学上可接受的载体。
[0010] 本发明还设及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明 所述浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核巧酸序列的步骤；2)表达所述步骤 1)的克隆核巧酸序列的步骤，得到所述浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，W 及3)使用所述步骤2)获得的浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，添加药学上 可接受的载体W及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
[0011] 本发明还设及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明 所述浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核巧酸序列，克隆所述曲蛋白核巧 酸序列的步骤；2)串联表达或融合表达所述步骤1)的克隆核巧酸序列的步骤，得到所述 浊-曲蛋白，W及3)使用所述步骤2)获得的浊-曲蛋白，添加药学上可接受的载体W及佐 剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
[0012] 本发明还设及本发明所述的浊蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段、所述 的浊-曲蛋白、W及所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病 病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
【附图说明】 阳01引 图1是猪伪狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株、Becker株浊蛋白的氨 基酸序列同源性比较，图IA显示各浊蛋白氨基酸序列1~约480位氨基酸残基间序列的 比较，图IB显示各浊蛋白氨基酸序列约481位及剩余的氨基酸残基间序列的比较。
[0014] 序列表中： 阳01引序列1为PRV HN1201株浊蛋白的核巧酸序列；
[0016] 序列2为PRV HNl201株浊蛋白的氨基酸序列； 阳017] 序列3为PRV HN1201株浊蛋白片段的核巧酸序列； 阳0化]序列4为PRV HN1201株浊蛋白片段的氨基酸序列；
[0019] 序列5为PRV Bartha株浊蛋白片段的核巧酸序列； W20] 序列6为PRV Bartha株浊蛋白片段的氨基酸序列；
[0021] 序列7为PRV Kaplan株浊蛋白片段的核巧酸序列；
[0022] 序列8为PRV Kaplan株浊蛋白片段的氨基酸序列；
[0023] 序列9为PRV Becker株浊蛋白片段的核巧酸序列； W24] 序列10为PRV Becker株浊蛋白片段的氨基酸序列； 阳02引序列11为PRV HN1201株曲蛋白的核巧酸序列；
[0026] 序列12为PRV HN1201株曲蛋白的氨基酸序列； W27] 序列13为PRV HN1201株浊蛋白片段和曲蛋白的融合蛋白核巧酸序列； 阳02引序列14为PRV HN1201株浊蛋白片段和曲蛋白的融合蛋白氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0029] W下，对本发明的实施方式进行说明。
[0030] 术语"浊蛋白"又称"浊糖蛋白"，在瘤疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白，其大小 约 2. m*。
[0031] 本发明的一个方面设及一种猪伪狂犬病病毒浊蛋白片段、或其保守性变异体或 其活性片段，其中，所述浊蛋白片段氨基酸包括位点W SEQ ID NO :2所示的猪伪狂犬病病 毒HN1201株浊蛋白序列为基准，浊蛋白约第62位至148位氨基酸所示序列和/或约第 546位至700位氨基酸所示序列，所述浊蛋白片段能保持与所述浊蛋白的抗原活性；所述 变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述浊蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几 个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述浊蛋白片段的抗原活性。
[0032] 不同猪伪狂犬病病毒株浊蛋白序列可能因氨基酸位点的插入、缺失，造成本发明 所述浊蛋白片段序列位置在不同猪伪狂犬病病毒株浊蛋白序列中存在差异，比如在猪伪 狂犬病病毒Bartha株对应氨基酸位置为浊蛋白第62位至150位W及第548位至702位， 在猪伪狂犬病病毒Kaplan株对应氨基酸位置为浊蛋白第62位至154位W及第552位至 706位，在猪伪狂犬病病毒Becker株对应氨基酸位置为浊蛋白第62位至147位W及第545 位至699位，其可通过与SEQ ID NO :2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株浊蛋白序列进行 比对，与猪伪狂犬病病毒HN1201株浊蛋白第62位至148位氨基酸所示序列W及第546位 至700位氨基酸所示序列对应的序列即为本发明所述浊蛋白片段序列。 阳03引浊蛋白片段的在浊蛋白序列上的氨基酸位点可通过DNAStar进行比对，W确定在 不同猪伪狂犬病病毒株中本发明所述的浊蛋白片段氨基酸序列对应的位点，通过比对猪 伪狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株和Becker株浊蛋白片段的氨基酸位点，结 果见图1。也可通过其他的生物学软件进行序列比对，W确定本发明所述的浊蛋白片段在 不同猪伪狂犬病病毒株中氨基酸位点，例如MEGA、DNAman、clustalX、bioedit、Vector NTI W及NCBI中的blast功能。
[0034] 本发明所用术语"保守性变异体"是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫 学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般的，多肤的保守性变异体的氨 基酸序列不同于母本多肤。但是差异是有限的，W使母本多肤序列与保守性变异体总体上 非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肤氨基酸序列的差异可W是 例如：一个或几个氨基酸残基及其任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基 可由遗传密码编码，也可由不遗传密码编码。多肤的保守性变异体可W自然产生，或者它可 W是非自然产生的变异体。多肤非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而 产生。
[0035] 本发明所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述浊蛋白片段的氨基酸序 列相比存在一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述浊蛋白片段的 抗原活性，其中，所述一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除意指一个至10个保守性 氨基酸替换、添加或删除，优选一个至5个保守性氨基酸替换、添加或删除。所述保守性氨 基酸替换、添加或删除意指性质相似、大小相当的替换、添加或删除，包括但不限于甘氨酸 与丙氨酸之间的替换，丝氨酸与苏氨酸之间的替换，精氨酸与赖氨酸之间的替换。
[0036] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒浊蛋白片段、或其保守 性变异体或其活性片段，其中，所述浊蛋白片段氨基酸包括位点W SEQ ID NO :2所示的猪 伪狂犬病病毒HN1201株浊蛋白序列为基准，浊蛋白第62位至148位氨基酸所示序列和/ 或第546位至700位氨基酸所示序列，所述浊蛋白片段能保持与所述浊蛋白的抗原活性； 所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述浊蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个 或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述浊蛋白片段的抗原活性。
[0037] 作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述浊蛋白片段来自 包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeNl株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和 NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJOl、猪伪狂犬病毒变异株HN1201 株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒化株、猪伪狂犬病病毒Bartha株、猪 伪狂犬病病毒Kaplan株、猪伪狂犬病病毒Becker株。
[0038] 猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离 和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7);猪伪狂 犬化Nl株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，其菌种保藏编 号为 CGMCCN0. 6656,公开于专利申请 CN102994458A ;NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株公开于 Pathogenic Pseudor油iesVirus, Xiuling 化，Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. China, 2012EmergingInfectious Diseases, www. cdc. gov/eid 0I.2O, No. I, January 2014 ;PRV TJ strain (PRV TJ)株，公开于 QiinaQum-Hua Wang Jin YuanI, Hua-Yang Qinl，et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV)provides rapid andcomplete protection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China Vaccine 32 (2014)3379 - 3385 中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJOI，其保藏号为CGMCCNo. 8170公开于CN103627678A ; 猪伪狂犬病毒 HN1201 株（Pseu