Hsp70l1单克隆抗体4e8及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体地说，是一种抗融合蛋白CEA日76-日閒HSP7化I(CH)的 单克隆抗体4E8,产生该种抗体的杂交瘤细胞株，W及运种抗体的免疫检测用途。
【背景技术】
[0002] 热休克蛋白化eat shock protein,HSP)家族按照分子量可W分为四类:Hsp90家 族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子化P家族。HSP在细胞内发挥分子伴侣作用，在新生肤的 正确折叠、转运W及对异常构象蛋白的降解中发挥重要作用化Ultz D. 2005.Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response.Annu.Rev.Physiol.67: 225-257.)。此外，HSP蛋白及其相连的蛋白多肤在细胞处于应激的条件时，会W复合物的形 式释放到细胞外。一些HSP，如GRP96，HSP70，HSP90，在细胞外具有免疫佐剂效应，能够刺激 机体免疫细胞产生针对其结合的蛋白肤段的特异性免疫应答（Baker-LePain J.C.， M.Sarzotti,and C.V.Nicchitta.2004.Glucose-regulated protein 94/glycoprotein 96elicits byst曰nder 曰ctiv曰tion of CD4+T cell Thlcytokine production in vivo.J.Immunol.172:4195-4203.Gong J.,Y. Zhang,J.Durfee,D.Weng,C.Liu,S.Koido, B.Song,V.Apostolopoulos,and S.K.Calderwood.2010.A heat shock protein 70-based vaccine with enhanced immunogenicity for clinical use .J. Immunol.184:488-496. Tanaka T.,K.Okuya,G.Kutomi,A.Takaya,T.Kajiwara,T.Kanaseki,T.Tsukahara, Y.Hirohashi,T.Torigoe,K.Hirata,Y.Okamoto,N. Sato, and Y.Tamura.2015. Heat shock protein 90targets a chaperoned peptide to the static early endosome for efficient cross-presentation by human dendritic cells.Cancer Sci.106:18-24.)。
[0003] 服P70L1是HSP70家族的一员，分子量约55kd。同服P70类似，HSP70L1在细胞外也具 有免疫佐剂效应，尤其是能够刺激一类抗原提呈细胞-树突状细胞(demlritic cell，DC)产 生炎性反应W及获得抗原提呈功能的成熟（Wan T.，X.Zhou, G.Chen, H.An, T.Chen, W.Zhang,S.Liu,Y.Jiang,F.Yang,Y.Wu,and X.Cao.2004.NoveI heat shock protein HspTOLlactivates dendritic cells and acts as a Thlpolarizing adjuvant.Blood. 103:1747-1754.)。本室制备的融合蛋白，癌胚抗原（CEA)的576-669段 (CEA576-669)融合至服P7化1的N端的融合蛋白能够诱导机体产生针对CEA的特异性免疫应答 反应。因此融合蛋白CH可用于针对CEA阳性的肿瘤治疗（Wu Y .，T. Wan，X. Zhou，B. Wang， F.Yang,N.Li,G.Chen,S.Dai,S.Liu,M.Zhang,and X.Cao.2005.HspTO-Iike protein !fusion protein enh曰nces induction of c曰rcinoembryonic 曰ntigen-specific CD8+ CTL response by dendritic cell vaccine.Cancer Res.65:4947-4954.)。
[0004] 我们新发现，编码融合蛋白（CH)的融合基因修饰的DC细胞也具有成熟DC的特征， 可W作为DC疫苗，诱导机体产生针对CEA的特异性免疫应答反应，因此也可W作为CEA阳性 肿瘤的治疗性疫苗（中国专利申请201010108973.9携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制 备方法和应用）。令人感兴趣的是，CH融合基因修饰的一些肿瘤细胞，能够上调表达MHC-I分 子，运暗示利用携带融合基因的表达载体，如重组腺病毒载体，进行基因治疗，一方面通过 转染CH基因进入体内的抗原提呈细胞，如DC，诱导机体产生针对CEA的特异性免疫应答;另 一方面，通过转染CH基因进入肿瘤细胞，可W提升肿瘤细胞表达MHC-I分子的水平增加被 CTL识别的可能性，也可W在不表达CEA的肿瘤细胞中引入CEA分子，从而使肿瘤细胞产生 MHC-CEA来源表位肤，使其能够被CEA特异性的CTL识别，从而被杀伤清除，实现肿瘤免疫治 疗的目的。
[0005] 因此，无论将来使用融合蛋白CH进行免疫治疗、还是融合基因修饰的免疫细胞进 行细胞治疗、W及携带融合基因的重组载体的基因治疗、都需要对血清、体液或者细胞中的 融合蛋白CH进行免疫检测，因此，研制出一种结合特异性高的抗CH的单克隆抗体具有重要 的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种能够具有高亲和力、特异性结合融合蛋白 CEA576-66讯SP70LUCH)的单克隆抗体，及其在制备用于检测融合蛋白CH的免疫检测工具中 的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种特异性结合融合蛋白CH的 单克隆抗体4E8，是由保藏编号为CCTCC NO: C201612的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0008] 还提供了一种特异性结合融合蛋白CH的单克隆抗体3C1，是由保藏编号为CCTCC N0:C201626的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0009] 本发明的第二方面，提供了 2株杂交瘤细胞株CH-4E8和CH-3C1，保藏于中国典型培 养物保藏中屯、（简称为CCTCC)，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号分别为CCTCC NO: C201612和CCTCC N0:C201626。
[0010] 本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
[0011] 单抗的筛选与制备:采用融合蛋白CH(SEQ ID N0:1)免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏 细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能 分泌抗CH特异性抗体的杂交瘤细胞，30株。其中2株巧一为4E8克隆株）的上清灵敏度达到 0.1 ng/孔(Ing/ml)，其余28株的上清灵敏度达到Ing/孔(lOng/ml)(结果见表1)。
[0012] 杂交瘤细胞分泌上清识别CH来源不同抗原特异性的鉴定:将上述杂交瘤细胞株的 上清，分别与CEA日76-6閒蛋白和HSP70L1蛋白作为抗原进行ELISA检测，其中有6株上清不识 另Ij，其余24株识别CEA日76-669蛋白。因此，初步判断有6株单抗识别的位点位于CH蛋白的 HSP70L1段，24株单抗的识别位点位于CEA日76-6閒段(结果见表2)。
[0013]本发明的第S方面，提供上述单克隆抗体4E8在制备检测细胞内融合蛋白CH表达 的试剂或试剂盒中的应用。
[0014] 所述的试剂或试剂盒是Western Blot、免疫组化或化ISA检测试剂或试剂盒。所述 的试剂或试剂盒是用于检测融合蛋白CH融合基因修饰的免疫细胞、肿瘤细胞或者其他哺乳 动物细胞中融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒。
[0015] 本发明提供了利用单克隆抗体4E8在制备用于检测细胞内CH蛋白的免疫检测工具 中的应用。具体地，所述免疫检测工具为4E8单克隆抗体，或者巧光素 W及其他偶联物偶联 的4E8单克隆抗体。使用本发明单克隆抗体可W检测CH融合基因修饰的细胞中，CH蛋白的表 达、亚细胞定位等，可用于进一步研究CH在细胞内的功能(结果见图2、3)。
[0016] 优选的，在上述应用中所述的单克隆抗体4E8与单克隆抗体3C1合用。
[0017] 本发明提供了利用两株单抗制备的化ISA试剂盒，用该试剂盒可W特异性的检测 至IjCH，而与HSP7化1和CEA日76-6閒无交叉反应，因此可用于将来血清、体液W及细胞中CH含量 的检测。方法如下:在识别CH蛋白的杂交瘤中，选择识别不同抗原表位的单克隆株上清，即 分别选择识别CEA日76-6閒的上清和可能识别HSP7化1段的上清，进行配对。ELISA结果显示，特 异性结合CEA576-6閒蛋白克隆号为4E8的杂交瘤分泌的上清，与特异性结合HSP7化1蛋白的克 隆号为3C1的杂交瘤上清，检测CH的灵敏度和特异性最好。分别制备运两株杂交瘤小鼠腹 水，通过亲和层析柱分别纯化单抗4E8和3C1。将4E8作为捕获抗体包被于酶标板，3C2作为检 测抗体。通过验证，该对单抗制备成的化ISA试剂盒，特异性、灵敏度W及线性度都适合于将 来的检测目的(结果见图1)。
[0018] 本发明的第四方面，提供上述单克隆抗体4E8在制备用于检测CEA阳性肿瘤的 ELISA试剂或试剂盒中的应用。
[0019] 本发明的第五方面，提供上述单克隆抗体3C1在制备检测细胞内融合蛋白CH表达 的试剂或试剂盒中的应用。
[0020] 本发明的第六方面，还提供了单克隆抗体3C1在制备检测细胞内天然表达HSP7化1 的试剂或试剂盒中的应用。可用于WB检测目的，与市售兔源多抗的效果一致。鉴于市售抗 HSP70L1的检测抗体多为兔源多抗，3C1单抗无疑具有更好的特异性(结果见图4)。
[0021] 本发明的第屯方面，提供了上述杂交瘤细胞株CH-4E8或CH-3C1在制备检测细胞内 融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用。所述的试剂或试剂盒是Western Blot、免疫组 化或ELISA检测试剂或试剂盒。所述的试剂或试剂盒是用于检测融合蛋白CH融合基因修饰 的免疫细胞、肿瘤细胞或者其他哺乳动物细胞中融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒。
[0022] 本发明的第八方面，提供了上述杂交瘤细胞株CH-4E8在制备用于检测CEA阳性肿 瘤的试剂或试剂盒中的应用。
[0023] 本发明的第九方面，提供一种用于检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒， 所述的试剂或试剂盒中包括单克隆抗体4E8。
[0024] 优选的，所述的试剂或试剂盒中还包括用于Western Blot、免疫组化或化ISA检测 的其他通用试剂。
[0025] 优选的，所述的试剂或试剂盒中还包括单克隆抗体3C1。
[0026] 所述的单克隆抗体4E8也可W组合其他抗HSP7化1抗体用于检测融合蛋白CH。
[0027] 所述的单克隆抗体4E8还可W组合其他抗体用于检测融合了 CEA576-668的相应融合 蛋白。
[002引本发明优点在于：
[0029]本发明所述针对CH蛋白的特异性单抗4E8和3C1，识别融合蛋白CH中的不同表位， 分别位于CH中CEA段和服P7化1段，并且具有高亲和力和特异性，奠定了基于CH的免疫治疗、 细胞治疗和基因治疗中用于CH检测的实验技术。此外，还建立了基于单抗4E8的免疫巧光技 术，可用于基于CH基因修饰哺乳动物细胞的鉴定和功能研究。此外，4E8是明确识别 CEA576-669段，在目前市售的CEA鼠源单抗中，免疫原多CEA全长蛋白或者笼统的标明为内部 片段，并没有确定位于本发明所述的CEA日76-6閒段，因此4E8为CEA阳性肿瘤的诊断添加了一 个新的检测工具。
[0030]本发明所述单克隆抗体可与CH蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反 应，具有CH蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
[0031 ]生物材料样品的保藏信