一种降解二香豆酸葡萄糖苷的细菌及其选育方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及筛选和鉴定对入侵恶性杂草紫茎泽兰化感物质二香豆酸葡萄糖巧有 降解作用的细菌领域，特别设及一种降解二香豆酸葡萄糖巧的细菌及其选育方法和应用。
【背景技术】
[0002] 紫茎泽兰（学名：Agerat i na adenophora Spr enge 1 或者Eupator ium adeno地orum)，又名解放草、破坏草、马鹿草、大黑草、花升麻、细升麻，为菊科泽兰族假蕾香 劑属多年生草本植物或亚灌木，原产于墨西哥和哥斯达黎加，自19世纪作为一种观赏植物 在世界各地引种后，因其繁殖力强，已成为全球性的入侵物种。在2003年由国家环保总局和 中国科学院发布的《中国第一批外来入侵物种名单》中名列第一位。植株高高20-150厘米， 最高可达2米，茎直立，呈暗紫褐色，茎枝被白色、灰色或诱色短柔毛，叶对生，叶片呈=角状 卵形、菱状卵形、菱状S角形或近S角形，长4-10厘米，宽2-7厘米，边缘具圆银齿，头状花序 通常在茎枝顶端排成伞房花序或复伞房花序，有40~50朵小花-。花序直径约1.5毫米，无 毛，具多数小窝孔。花冠白色，极稀淡黄色或淡红色，长3.5~4毫米，冠管极细，与冠檐近等 长或稍长-。行有性和无性繁殖。每株可年产瘦果1万粒左右，藉冠毛随风传播。根状茎发达， 可依靠强大的根状茎快速扩展蔓延。
[0003] 紫茎泽兰作为全球性的入侵物种目前已经入侵到美洲、亚洲、非洲、大洋洲和欧洲 的30多个国家和地区。紫茎泽在中国于1935年在云南南部首次发现，可能经细甸、老拋或越 南传入。目前主要分布于我国的西南地区，如云南、广西、贵州、四川、湖北、重庆、西藏W及 台湾等都有分布，垂直分布上限为海拔2500米，并且每年W20km的速度向北和向东扩散。紫 茎泽兰自19世纪作为一种观赏植物在世界各地引种后，经历了近一个世纪的繁衍并野化， 已成为全球性的入侵物种，造成广泛的生态性灾害。其繁殖力极强，在其发生区常形成单种 优群落，排挤本地植物;侵入经济林地和农田，影响栽培植物生长;堵塞水渠，阻碍交通，全 株有毒性，牲畜误食会引发疾病甚至死亡，危害畜牧业。目前从紫茎泽兰植物根、茎、叶、花 和果实中提取到大约50种水溶性和脂溶性的化感物质，运些化感物质对许多本地植物都产 生强烈的化感作用，其化感作用是促进紫茎泽兰入侵成功的因素之一。二香豆酸葡萄糖武 (2-couma;ric acid glucoside)为紫茎泽兰产生的众多化感物质之一，其理论含量为植物 干重的万分之八，比其它发现的化感物质含量都高，其分子式见图1。目前为止，许多物理、 化学和生物的方法都在试图恢复自然的生境，并且也取得了一些成功。尽管对入侵生物进 行治理的最终目标是在生物入侵的地方恢复本地种，然而有时候在像被紫茎泽兰运样的入 侵植物入侵过的生境即使紫茎泽兰被控制或是去除了，想要进行恢复却是很困难的事，因 为入侵者产生的化感物质还残存在上壤中，入侵者产生的调落物也会经常不断的释放化感 物质。因而如何减轻或者消除入侵植物化感作用就成为在入侵群落进行植被恢复时的一个 重要的步骤。针对运一紧迫问题，我们从±壤中筛选和鉴定对入侵恶性杂草紫茎泽兰化感 物质二香豆酸葡萄糖巧有降解作用的细菌进行了发明研究。
[0004]
[0005] 二香豆酸葡萄糖武分子式
【发明内容】
[0006] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种降解二香豆酸葡萄 糖巧的细菌及其选育方法和应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[000引一种降解二香豆酸葡萄糖巧的细菌，其为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称化)是一种革兰氏阳性细菌，有效成分伴胞晶体是由分子量2.7-14万 道尔顿的=大类蛋白质组成，具有蛋白质的理化性能。化的另一有效成分芽抱是活的菌体. 条件适宜即萌发，生长，繁殖。保藏单位为：中国典型培养物保藏中屯、，CCTCC;保藏编号： CCTCC N0:M 2016135,保藏日期为2016年3月21 日。
[0009] 上述一种降解二香豆酸葡萄糖巧的细菌的选育方法包括如下步骤：
[0010] 步骤一、从紫茎泽兰入侵样地中提取细菌培养提纯：
[0011] 1、从紫茎泽兰入侵样地中取±壤500邑，自然凉干后，用研磨机粉碎过40目筛，从± 壤样品中称取lg±壤加入9ml蒸馈水，放入180转/分钟，25°C的摇床中摇24小时，然后吸取 Iml的上清液连续二次稀释10倍，再取0.1ml稀释后的溶液均匀涂布于直径为9cm的NA培养 基平板；
[0012] 2、每份稀释样重复涂布=次，涂布完的培养皿放入28°C的培养箱中于黑暗中培养 48小时；
[0013] 3、对其中菌藻形态为白色皱形的细菌进行进行分离培养，并每隔24h检查1次菌落 生长情况，再挑选单菌落分离培养，直到没有新的菌落出现；
[0014] 步骤二、对分离的细菌单菌落进行分子鉴定：
[0015] 1细菌的培养及染色体DNA的提取
[0016] 挑取待检菌分别接种于NA液体培养基，37 °C振摇培养过夜；
[0017] 1.1用2ml离屯、管收集1.0 X IO9其中，Iml菌液0D600为1-1.5，的细菌培养物，12， OOOXg离屯、30s，弃尽上清；用15化1已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀；
[001引1.2加入溶菌酶胆存液，混合均匀，室溫静置5min;
[0019] 1.3 加入30iU 0.25M EDTA(抑 8.0)，混合均匀，冰浴5min;
[0020] 1.4 加入45化1 Buffer G-A，旋满振荡 15s，65°C水浴lOmin;
[0021] 1.5 加入4°C预冷的40化1 Buffer G-B和Iml Buffer DV，用力混合，12,000Xg离 屯、2min;
[0022] 1.6尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相;加入1ml 4°C预冷Buffer DV，用力混 合，12 ,OOOXg 离屯、2min;
[0023] 1.7丢弃上相，将下相转移至置于2ml离屯、管中的滤器;12,000Xg离屯、Imin;
[0024] 1.8弃滤器，在滤液中加入40化1 Buffer BV，混合均匀；
[0025] 1.9将制备管置于2ml离屯、管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000Xg离 屯、Imin;
[0026] 1.10弃滤液，将制备管置回到原2ml离屯、管中，加入50化1 Buffer Wl，12,000Xg 离屯、Imin;
[0027] 1.11弃滤液，将制备管置回到原2ml离屯、管中，加入70化1 Buffer W2，12,000Xg 离屯、Imin;
[002引 1.12 W同样的方法再用70化1 Buffer W2洗涂一次；
[00巧]1.13弃滤液，将制备管置回到原2ml离屯、管中，12,000Xg离屯、Imin;
[0030] 1.14将制备管置于另一洁净的1.5ml离屯、管中，在silica膜中央加100-20化1 Eluent或去离子水，室溫静置Imin。12,000 X g离屯、Imin洗脱DNA;
[0031] 2细菌基因组PCR扩增
[003^ 2.1引物设计
[0033] 27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
[0034] 1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
[0035] 2.2 PCR扩增反应体系
[0036] 在0.2ml离屯、管中加入W下成分：
[0037]
[0038] 轻弹混匀，瞬时离屯、收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应 参数如下：
[0039] 预变性变性退火延伸终延伸循环数95°C，5min 95°C，30s 58°C，30s 72°C，90s 72 °C，7m 35
[0040]反应完成后，取3ul PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测；确认PCR扩增片段，扩 增片段的大小为1470bp;
[0041 ] 3 PCR产物的回收
[0042] PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步 骤如下：
[0043] 3.1在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离屯、管中，称取重量；
[0044] 3.2加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C加热直至凝胶块完全烙 化；
[0045] 3.3力日0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于 400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；
[0046] 3.4将混合液，转移到DNA制备管12,OOOXg离屯、Imin。弃滤液；
[0047] 3.5将制备管置回2ml离屯、管，加SOOiil Buffer Wl，12,OOOXg离屯、30s，弃滤液； [004引 3.6将制备管置回2ml离屯、管，加700iU Buffer W2,12,000 Xg离屯、30s，弃滤液； W同样的方法再用70化1 Buffer W2，12,000Xg离屯、Imin;
[0049] 3.7将制备管置回2ml离屯、管中，12,000Xg离屯、Imin;
[0050] 3.8将制备管置于洁净的1.5ml离屯、管中，在制备膜中央加25-3化1去离子水，室 溫静置 Imin; 12 ,OOOXg 离屯、Imin 洗脱 DNA;
[0051] 4序列测定与分析
[0052] 取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-)(L进行DNA测序；
[0053] 测序