一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，属于酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶化C 3.1.1.3)，即=酷甘油醋水解酶，是一种广泛存在于动物、植物和多种 微生物中的生物催化剂，最早发现于1901年，其主要催化功能在于可W在水-脂界面水解长 链=脂酷甘油醋。脂肪酶之所W在生物催化中倍受关注，除了其具有催化化合物醋键水解 的能力外，还由于脂肪酶在非水相中可W催化反向的醋化反应和转醋化反应，因而在生物 化工领域受到广泛的重视。脂肪酶能够进行非常特殊的化学转化(生物转化)使得它们在食 品，洗涂剂，化妆品，有机合成和制药工业中日益流行。例如加工食品，治理废水，生物表面 活性剂的合成，处理木材纤维素纸浆纸树脂，手性药物的生物合成等。此外，脂肪酶还具有 稳定性佳，转化效率高等优点，在芳香醋、生物柴油、手性化合物的生产中具有良好的应用 价值。
[0003] 虽然脂肪酶都具有催化各种化合物醋键水解的能力，但是能够催化非水相醋化反 应的脂肪酶种类却非常有限，绝大部分微生物脂肪酶都不表现出明显的催化非水相醋合成 的能力。有些脂肪酶在异源表达之后也只表现出显著的水解活性，相对于其野生型的脂肪 酶严重丧失了催化醋类合成的能力。运一现象严重制约了脂肪酶在工业生产中的应用。
[0004] -些蛋白质修饰技术可W用来调节和提高酶的活性，如有机溶剂修饰、固定化技 术等，但运些技术往往无法从本质上改变脂肪酶的催化性能。蛋白质的变性复性技术也可 W调整蛋白质的活性，主要应用于包涵体的复性。许多真菌蛋白在细菌中无法表达或W无 活性的包涵体形式存在。通常使用高浓度的还原剂使包涵体进行可逆变性，通过稀释或透 析降低还原剂的浓度，从而使蛋白在低浓度或无还原剂的情况下重新折叠形成可溶的蛋白 溶液。也有学者通过在包涵体的复性过程中加入有机溶剂、表面活性剂等促进包涵体的溶 解。然而大部分包涵体经过变复性处理后，仍旧达不到理想的活性，通过变性复性处理通常 更不会使得蛋白质催化活性发生转变或得到其他活性重塑。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明通过添加膜环境复合物，为变性的脂肪酶蛋白肤链提 供一个类似膜的模拟疏水环境，在缓慢复性的过程当中使脂肪酶重新折叠形成适当的高级 构象，从而实现催化醋化反应能力的恢复，对于其他脂肪酶的改造和制备也提供了有价值 的方案。
[0006] 本发明提供了一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，利用添加环境因子的结 构重塑方法获得具有高醋化活性的脂肪酶。本发明采用体外重折叠的方法对脂肪酶进行处 理，获得了具有催化醋合成能力的脂肪酶，解决了许多脂肪酶不表现醋化活性W及脂肪酶 在工程菌异源表达后丧失醋合成能力的问题，为拓宽脂肪酶的工业应用奠定了基础。
[0007] 所述活性重塑方法，是对脂肪酶进行变性和复性处理，在变性或者复性的过程中 添加膜环境复合物，模拟天然细胞环境，使复性的脂肪酶重新恢复合成醋的能力，获得高的 醋合成活性。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为外源表达的华根霉成熟肤脂肪酶(包 括包涵体）、华根霉脂肪酶r27R化、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶Lipozyme TL 1M、洋葱假单胞 菌脂肪酶62309或南极假丝酵母脂肪酶CALB。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述变性处理是采用常规的变性方法对脂肪酶进行 处理。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述变性处理，可W是用高浓度尿素、盐酸脈等变性 剂处理，溶解脂肪酶蛋白样品。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述变性处理具体是:在脂肪酶的蛋白溶液中缓慢 加入尿素粉末，低溫下揽拌，测定水解活性，活性完全丧失即判断=级结构完全打开形成肤 链，蛋白全部变性;离屯、取上清。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述变性处理后的蛋白，调整至蛋白浓度不高于 2.5mg ? mL-i，W保证蛋白能够完全的进行复性。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物是指来自华根霉菌体细胞的膜环 境复合物。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述华根霉是W下任意一种或者多种:华根霉CCTCC M20102UCCTCC AF 9314UCCTCC AF 93158、CICC 309UCICC 40720(均为已公开或可购买 得到的菌株，不需要提交保藏证明）。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，是先从培养好的华根霉 菌体上利用化iton X-100、CHAPS、Tween 80、脱氧胆酸等表面活性剂提取膜环境复合物及 膜结合蛋白，然后通过吸附提取液中的表面活性剂使膜结合蛋白沉淀，经离屯、分离后所得 上清液即为膜环境复合物。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述吸附是使用美国bio-rad伯乐公司Bio-Beads SM-2吸附剂吸附去除表面活性剂。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，具体是：（1)利用华根霉 菌体经丙酬洗涂制备丙酬粉；（2)将丙酬粉悬浮于憐酸缓冲液中，揽拌、离屯、、取沉淀、洗涂 两次W上，然后将洗涂后的沉淀重新悬浮于含有0.05-0.15%化iton X-IOO的憐酸缓冲液 中，揽拌、离屯、，将得到的沉淀悬浮于1-2%化iton X-IOO憐酸缓冲液中，振荡4-12小时、离 屯、，得到的上清液为膜环境复合物及膜结合蛋白；（3)在提取液中加入吸附剂Bio-beads，振 荡、离屯、，所得上清液即为膜环境复合物WTS。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述野生型膜结合脂肪酶RCL提取过程中悬浮或者 重悬，是将固体(比如丙酬粉或者沉淀很照m/v为1:8-1:12的比例。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述憐酸缓冲液为2.5mmol ? [1抑6.2憐酸缓冲液。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)或步骤(2)的揽拌、离屯、，是用磁力揽拌 3-lOmin、在8000-12000r ? min-i离屯、12-18min。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)或（3)中的振荡、离屯、，是在4°C溫和振 荡4-12h、于 12000-1500化? min-i下离屯、15-30min。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物短期内4°C储存备用。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述复性是将变性处理得到的蛋白溶液与膜环境复 合物混合，然后装入透析袋中进行透析复性。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述蛋白溶液与膜环境复合物是按照体积比1:1混 厶 1=1 O
[00巧]在本发明的一种实施方式中，所述透析复性，是透析袋经6M-4M-2M-0M尿素-PBS透 析液梯度透析，使蛋白充分复性。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述透析复性，具体是:先放置于6M尿素的憐酸缓冲 液中，待透析袋内外盐平衡之后，将透析液更换为4M尿素的憐酸缓冲液，然后更换为2M尿素 的憐酸缓冲液，再更换为不含尿素的憐酸缓冲液，透析结束后取出复性蛋白，离屯、得上清液 即为重折叠的脂肪酶。
[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述活性重塑方法，在变性或复性时单独添加膜环 境复合物，或者同时添加膜环境复合物和表面活性剂。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂为CHAPS等两性离子表面活 性剂、孤M、Ci2Es Jasade-EM非离子表面活性剂、CTAB阳离子表面活性剂等多种，其中化iton X-IOO、DiC6PC或者LPC14效果较好。但不限于上述表面活性剂。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂的添加量为0.1~lOOmM。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂后，可W进一步提高华根霉 脂肪酶r27R化、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶Lipo巧me TL 1M、洋葱假单胞菌脂肪酶62309、南 极假丝酵母脂肪酶CALB等的醋化活性和/或总醋化活性回收率。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] (1)蛋白质的构象及性质与其所处的环境紧密相关，本发明通过添加膜环境复合 物，模拟蛋白折叠所处的细胞膜微环境对脂肪酶进行体外活性重塑改造，实现脂肪酶醋合 成能力的恢复，成功获得恢复了高醋化活性的可溶性脂肪酶。
[0033] (2)本发明的方法对E.COli表达的华根霉成熟肤脂肪酶RCL及其包涵体、毕赤酵母 PicMa pastoris表达的华根霉脂肪酶r27R化、商品化黑曲霉脂肪酶A、商品化疏棉状嗜热 丝抱菌脂肪酶Lipozyme TL 1M、商品化洋葱假单胞菌脂肪酶62309、商品化南极假丝酵母脂 肪酶CALB等多种脂肪酶均可适用，能够使脂肪酶醋化活性从无变有或者提高2.2-260倍、总 醋化活性回收率达1〇5%-299%。
[0034] (3)本发明还通过在变性或者复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂，进一 步提高了华根霉脂肪酶r27R化、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶Lipozyme TL 1M、洋葱假单胞菌 脂肪酶62309、南极假丝酵母脂肪酶CALB等脂肪酶醋化活性和/或总醋化活性回收率。
【具体实施方式】
[0(X3日]脂肪酶测定方法：
[0036] (1)对硝基苯酪栋桐酸醋(pNPP)法测定脂肪酶水解活力：
[0037] 脂肪酶水解pNPP产生对硝基苯酪和栋桐酸，对硝基苯酪在pH 8.0的缓冲中显黄 色，且在410nm波长处有最大的吸收峰，通过测定对硝基苯酪在410nm处的吸收值可测定脂 肪酶的活力。
[0038] 反应底物：
[0039] 底物一 ：0.25g阿拉伯胶+0.52g脱氧胆酸钢用50mmol ? L-I的pH = 8.0的憐酸