真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及纳米生物传感W及生物检测领域，具体设及一种真菌霉素脱氧雪腐镶 刀菌締醇的检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 脱氧雪腐镶刀菌締醇(deo巧nivalenol，D0N)，又称呕吐毒素，是一种B型单端抱霉 締族化合物，主要由禾谷镶刀菌和粉红镶刀菌产生，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物巧实 中，也污染粮食制品。DON对人畜可W产生广泛的毒性效应，属于剧毒或中等毒物，可致呕 吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，与贫血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切联系，另外， 它还常与其它的霉面毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可W相互影响。DON是 世界性的，特别是在中国、日本、美国、阿根廷、南非。在我国是胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发 区居民饮食中的主要污染霉菌毒素之一。如我国林县、磁县主要粮食面粉和玉米中的DON检 出率分别为53.8%和100%，林县样品（玉米）中DON平均含量为384~9686ng/g;磁县霉菌污 染更为严重，DON平均含量在玉米中为7959ng/g，面粉中为1032ng/g。因此粮食及制品中DON 的含量监控意义重大。
[0003] 目前检测DON的方法主要有薄层色谱、酶联免疫、气相色谱、液相色谱、免疫分析 等，色谱法对操作技术要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生 化试剂，而且运些生化试剂存在容易失活等不足。其中酶联免疫法化LISA)具有快速、方便、 预处理简捷等优点，但化ISA的所需DON高效、特异的单抗或多抗制备工艺复杂，所用抗体普 遍存在与DON的乙酷化类似物的交叉反应，易出现假阳性;专利CN 102559686A公开了一种 脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体并应用于DON的检测，该法用于DON检测具有高选择性和快速 的特点，但需要用到价格昂贵的修饰的DNA。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种简单、快速、灵敏的高选择性真菌毒素脱氧雪腐镶刀菌締醇的检 测方法，该方法主要包括W下步骤：
[0005] (1)将脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt与单链信号探针ssDNA杂交，形成 DONAp-ssDNA 杂交链；
[0006] (2)向DONApt-ssDNA杂交链溶液体系中加入待测样品，当待测样品中有脱氧雪腐 镶刀菌締醇DON存在时，DONApt-ssDNA杂交链选择性地与DON反应生成DONApt-DON,同时释 放出单链信号探针ssDNA;
[0007] (3)消除体系中剩余杂交链的干扰:DONApt-ssDNA杂交链经DNA扩增，形成双链 DNA;双链DNA在核酸外切酶III选择性地催化作用下，迅速水解成单核巧酸而除去；体系中 单链信号探针ssDNA不水解而被保留下来；
[0008] (4)向体系中加入巧樣酸钢、银离子溶液和还原剂，若体系中有单链信号探针检 ssDNA存在，则银离子被诱导生成被ssDNA修饰的近红外巧光银纳米簇(DONApt-DON不能诱 导银离子还原成近红外巧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能诱导生成具有强巧光的 近红外银纳米簇）；
[0009] (5)测定体系中近红外巧光强度，根据近红外巧光强度与DO脚农度的关系计算待测 样品中的DON的含量。
[0010] 上述的先后添加的巧樣酸钢、银离子和使银离子迅速还原成近红外巧光银纳米簇 的还原剂维生素C构成银离子还原检测体系。
[00川所述脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt为5'-GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3'0
[0012] 所述的单链信号探针ssDNA为5' -CCCCCCACACCCGATCCCCCC GCACTTCACACGATA-3'。
[0013] 进一步地，步骤(1)所述的杂交，脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt与单链信号 探针ssDNA的物质的量之比为1:1;杂交前先分别配成各自的化is-HCl溶液，然后在85~95 °C加热5~10分钟后立即置于冰浴中5~10分钟，Tr i S-HCl溶液优选浓度50mmo 1 /L，pH为 7.5;杂交溫度为37°C (此处的杂交溫度要求非常严格，只能是37°C，低了，反应难趋于完全， 高了，杂交链会重新分开），时间为1小时W上(1小时就能确保反应完全）。
[0014] 进一步地，步骤(2)中，DONApt-ssDNA杂交链的物质的量大于待测样品中脱氧雪腐 镶刀菌締醇DON的物质的量。
[0015] 进一步地，步骤(3)的扩增水解，具体为:在步骤(2)所得反应液中依次加入扩增缓 冲溶液、dNTP溶液和化i29DNA聚合酶溶液，混匀后反应10~20分钟，再分别加入NHaF-^CI 和核酸外切酶III溶液，在37 °C下继续反应20~30分钟;扩增缓冲溶液、dNTP溶液、Phi29DNA 聚合酶溶液、NH4F-化Cl溶液、Exo III的体积比为10:18:2:10:2,扩增缓冲溶液由50mM Tris-HCl，10mM MgCb和 10mM(NH4)2S〇4组成，pH为7.5，dNTP溶液的浓度为 10mM，Phi29DNA聚 合酶溶液的浓度为IOuAil，NH4F-NaCl溶液由50mM的NH4F溶液与0.2M的NaCl溶液等体积混合 而成，Exo III溶液的浓度为20u/化;脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体D0NApt、PM29DNA聚合 酶、Exo III的配比为 120nmol:20u:40u。
[0016] 进一步地，步骤(4)的还原具体为:在步骤(3)所得反应液中加入硝酸银溶液和巧 樣酸钢缓冲液，再在室溫下避光或暗室中放置10~15分钟后，快速揽拌下加入还原剂溶液， 然后在45°C下反应5~10分钟;硝酸银溶液、巧樣酸钢缓冲液、还原剂的体积比为1:10:6;巧 樣酸钢缓冲液的浓度为IOmmo 1/L，pH为8;还原剂优选为维生素C溶液，浓度为1mmol/L，pH为 8;硝酸银溶液与脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt的配比为0.5mmol: 3皿〇1。
[0017] 本发明的检测原理如下：先让DONApt与ssDNA杂交（下划线部分），形成DONApt-ssDNA 杂交链； 向 DONApt-ssDNA 杂交链溶液体系中加入待测样品 ，当待测样品中有 DON 存在 时，DONApt-ssDNA杂交链选择性地与DON反应生成DONApt-DON,同时释放出单链信号探针 ssDNA;体系中存在D0NApt-ssDNA(剩余的），DONApt-DON和ssONAsDONApt-DON不能诱导银离 子还原生成近红外巧光的银纳米簇，对测定无干扰;杂交链可能有干扰;采取W下措施消除 杂交链的干扰:a. DONApt-ssDNA杂交链经DNA扩增，形成双链DNA; b.双链DNA在核酸外切酶 选择性地催化作用下，迅速水解成单核巧酸除去;此时体系中可诱导生成近红外巧光的银 纳米簇的只有单链信号探针ssDNA;向体系中加入巧樣酸钢、银离子溶液和维生素C溶液，在 ssDNA诱导下，银离子还原成被ssDNA修饰的近红外巧光银纳米簇；W波长为590nm左右的光 为激发光，测定体系巧光发射(610-680nm)光谱的巧光强度，从而确定真菌毒素脱氧雪腐镶 刀菌締醇的含量。由于消除体系中背景巧光的干扰，可W提高检测的灵敏度和精度。
[0018] 本发明还提供了一种检测脱氧雪腐镶刀菌締醇的试剂盒，包括:脱氧雪腐镶刀菌 締醇核酸适体DONApt、能够与脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、 DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
[0019] 所述银离子还原检测体系包括先后添加的巧樣酸钢溶液、银离子溶液及使银离子 还原成近红外巧光银纳米簇的还原剂溶液，所述的还原剂优选维生素C。
[0020] 所述脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt为5'-GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGT ATCGTGTGAAGTGC-3'。
[0021] 所述的单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCC GCACTTCACACGATA-3 '。
[0022] 所述DNA扩增体系包括S憐酸脱氧单核巧酸混合物dNTP溶液、PM 29DNA聚合酶、 NH4F-NaCl溶液和扩增缓冲溶液，所述的扩增缓冲溶液由化iS-HCl、MgCb、（畑4)2S〇4组成。
[0023] 所述核酸外切酶为核酸外切酶III即Exo III。
[0024] 本发明还提供了一种可用于检测脱氧雪腐镶刀菌締醇的脱氧雪腐镶刀菌締醇核 酸适体DONApt，其碱基序列为5 ' -GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGT ATCGTGTGAAGTGC-3'。
[0025] 本发明的有益效果在于：
[0026] 根据本发明的检测方法和试剂盒，可W消除背景巧光的干扰，提高了脱氧雪腐镶 刀菌締醇的检测灵敏度和精度。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于此。
[0028] 实施例1
[0029] 一种检测真菌毒素脱氧雪腐镶刀菌締醇的试剂盒，包括:脱氧雪腐镶刀菌締醇核 酸适体DONApt、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶III、银离子还原检测体系。 DONApt为5 '-GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGT ATCGTGTGAAGTGC-3 '。单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATA-3'dDNA扩增体系包括S憐酸脱氧单核巧酸混合物dNTP溶液、PM29DNA聚合酶、NH4F-NaCl溶 液和扩增缓冲溶液，扩增缓冲溶液由Tris-HCl、MgCb、（NH4)2S〇4组成。核酸外切酶为Exo III。所述的银离子还原检测体系包括巧樣酸钢溶液和还原剂维生素C溶液。
[0030] 实施例2
[0031] -种检测真菌毒素脱氧雪腐镶刀菌締醇的方法，具体操作过程如下：
[0032] 将脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体D0NApt的化is-HCl(50mM，抑7.5)溶液和单链信 号探针ssDNA的化iS-HCl溶液在90°C下加热5分钟，迅速置于冰浴中5分钟，取出，使其在室 溫下保存备用。
[0033] 分别取经上述处理过的含3.0皿Ol脱氧雪腐镶刀菌締醇核酸适体DONApt溶液40化 和3.0皿〇1信号探针ssDNA溶液40化置于2ml离屯、管中，在37°C下杂交反应1小时；按上述方 法制备若干份杂交溶液，然后分别向上述杂交溶液中加入扣L浓度为0~lOOOng/mL的脱氧 雪腐镶刀菌締醇，使浓度（按体积为470化时计算的DON浓度）依次为Ong/mUO.OOlng/mU 0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.5ng/mL、l.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、 50.0 ng/mL，混匀，反应2分钟后，再向上述各反应体系中分别加入IO化pH 7.5的扩增缓冲 溶液(缓冲溶液组成为50mM IYis-肥l，10mM MgCl2、10mM(NH4)2S〇4)、l祉L dNTP(lOmM)溶液 和化L化i29DNA聚合酶（1 OuAU)溶液，混匀，反应10分钟后，再向上述各反应体系中分别加 入10化NH4F(25mM)-化Cl(O.lM)和化L Exo III核酸外切酶(2〇11/化），在37°C下继续反应 20分钟。
[0034] 再分别向上述各反应液中加入20化Immol硝酸银溶液和20化L巧樣酸钢缓冲液 (10mM，pH 8)。然后，混合物在室溫下避光或暗室中放置10分钟后，在快速揽拌下，再分别向 上述各反应液中加入12化L浓度为ImM,pH 8的新制备的维生素C溶液。然后在45°C下反应5 分