鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域中重组蛋白的生产和纯化方法，特别设及鸡生长激素重 组蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化方法。
【背景技术】
[0002] 鸡生长激素（chicken growth hormone，cGH)不仅对鸡的正常生长发育起着必要 的调节作用，而且对鸡的多种生产性状也有着显著的影响，如体重、饲料转化率、脂肪蓄积、 蛋生产、抗病性等。此外，通过注射外源GH，可W在胚胎时期显著提高鸡胚重量，促进其长骨 及软骨组织的发育，从而提高肉用品种鸡的上市体重。相对于人和哺乳动物的生长激素的 研究，鸡生长激素的研究起步较晚，但是随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系 统被建立并得到应用，酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和 对表达产物的加工修饰能力，表现出不可比拟的优势。其中毕赤酵母(PicMa pastoris)表 达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统，目前还未见任何鸡生长激素重 组蛋白在毕赤酵母中表达的报道。
【发明内容】
[0003] 发明目的:本发明提供一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化 方法，通过该方法获得高纯度且具有活性的鸡生长激素重组蛋白。
[0004] 技术方案:为了达到上述发明目的，本发明提供的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵 母中的表达及纯化方法，包括W下步骤：
[0005] (1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，WcDNA为模板，PCR得到鸡 生长激素的基因片段，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示；
[0006] (2)将步骤(1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体PPIC9K，并在C端添加6个 His标签，得到重组表达载体pPIC9K-cGH;
[0007] (3)重组表达载体pPIC9K-c(iH电转化毕赤酵母GS115,并通过组氨酸缺陷筛选和 G418筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH;
[000引（4)通过甲醇诱导表达，经儀柱、凝胶柱纯化得到鸡生长激素重组蛋白。
[0009] 所述鸡生长激素(chicken growth hormone,cGH)的基因位于1号常染色体的长臂 末端，全长约为4kb，由5个外显子及4个内含子构成。CGH由191个氨基酸组成，分子量约为 22KDa，与鸭的生长激素具有很高的同源性，只有4个氨基酸的差异，与火鸡生长激素的同源 性为96% Xenbank已公布的鸡生长激素mRNA序列(NM_204359)。
[0010] 所述鸡生长激素基因片段的碱基序列如SEQ ID N0:1所示，其编码的重组蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 所述步骤(2)重组表达载体的构建中，为了便于后续纯化重组蛋白，将步骤（1)所 得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体PPIC9即寸，需要在C端添加6个化S标签。其操作可W 借助于含有化S标签的祀T-30a( + )载体，具体为:将步骤（1)所得基因片段插入含有化S标签 的祀T-30a( + )载体，并W其为模板，PCR扩增得到含有化S标签的鸡生长激素的基因片段并 插入毕赤酵母分泌表达载体PPIC9K，得到重组表达载体PPIC9K-C細。其中，可W先将步骤 (1)所得基因插入PMD19-T载体，命名为PMD19-T-CGH，然后根据设计引物进行上述PCR扩增。
[0012] 所述步骤(3)具体可W为:将构建好的PPIC9K-CCT1重组表达载体用SacI线性化，然 后与毕赤酵母GS115感受态细胞混合，经电转之后培养长出转化子。将所有转化子用无菌去 离子水洗下涂含有不同浓度G418的YTO平板，培养筛选高拷贝数的转化子。采取煮-冻-煮法 提取转化子基因组，做PCR鉴定，鉴定正确的高拷贝转化子命名为GS115-pPIC9K-cGH。
[0013] 所述电转条件为1500V，6ms。
[0014] 所述步骤(4)具体可W为:将转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-c(iH单菌落接种 于培养基中培养活化;将活化后的菌液接种于BMGY培养基中，培养16-2化至0D600达到2-6， 2500 X g，5min离屯、收集菌体，换用BMMY培养基诱导表达，添加甲醇连续诱导，筛选出高表达 困株。
[0015] 所述诱导表达所用甲醇为培养基体积的1 %。
[0016] 所述诱导表达时间为24-9化，最优表达时间为96h。
[0017] 步骤(4)中儀柱、凝胶柱纯化具体为：取IOOmL的GS115-PPIC9K-C細诱导上清，用 8000邸a透析袋在儀柱化结合液中透析1她，每化换一次液;将透析后的诱导上清用儀柱纯 化，再采用凝胶层析方法去除其中杂蛋白，即得纯度达到95% W上的鸡生长激素重组蛋白。 最后通过细胞活性试验鉴定所得重组蛋白的活性。
[0018]有益效果：本发明首次实现鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达并纯 化，从而得到高纯度的鸡生长激素重组蛋白；产生的目的蛋白可W直接分泌到培养液中，方 便分离，而细胞可W被重新利用进行诱导目的蛋白，可应用于连续发酵生产的模式，大大提 高目的蛋白的产生，提高发酵效率，简化发酵过程和降低成本;同时避免了原核细胞所产生 的一些内毒素物质和热源等一些不易去除的物质，目的蛋白纯度更高。即本发明方法操作 简单、产量高、成本低。
【附图说明】
[0019] 图l:pPIC9K-c細重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图（M为DL2000DNA Maker;l为 EcoRI、Not I双酶切的pPIC9K-c(iH重组载体。经双酶切后产生一条60化P左右的cGH条带和 一条大于2000bp的质粒条带，表明cGH序列已成功插入表达载体。）
[0020] 图2:GS115-pPIC9K-cGH基因组PCR检验琼脂糖电泳分析图(M为DL2000DNAMaker;l 为阴性对照;2-6为W不同转化子基因组做模板PCR产物。提取转化子基因组做PCR能得到与 C細大小相符的条带说明PPIC9K-C細成功转入GS115。）
[00別]图3:GS115-pPIC9K-cGH不同诱导时相培养上清的SDS-PAGE电泳分析图（M为 Premixed Protein Marker; 1为诱导96h的上清；2为诱导7化的上清；3为诱导4她的上清；4 为诱导2地的上清。）
[0022] 图4: GSl 15-PPIC9K-C細诱导上清儀柱纯化SDS-PAGE电泳分析图（M为Premixed Protein Marker; 1为诱导液上清;2为过柱液;3、4为50mM咪挫洗涂液;5、6为IOOmM咪挫洗涂 液;7、8为SOOmM咪挫洗脱液。结果表明，洗涂液咪挫为50mM时可洗掉部分杂蛋白，当咪挫浓 度提高IOOmM时目的蛋白开始被洗下，用SOOmM咪挫洗脱可得到大部分预测大小为25KDa左 右的鸡生长激素重组蛋白，但是纯度不高。）
[0023] 图5:鸡生长激素重组蛋白凝胶层析纯化SDS-PAGE电泳分析图（M为Premixed Protein Marker; 1为儀柱纯化得到的重组蛋白；2、3、4分别为凝胶层析不同峰中的蛋白。从 4中单一条带可W看出，经凝胶层析后可得到纯度较高的鸡生长激素重组蛋白。）
[0024] 图6: LMH细胞经鸡生长激素重组蛋白处理后IGF-I mRNA相对于内参GAPDH表达量 柱状图（C細-为PBS处理的阴性对照组；C細巧00为500ng/mL鸡生长激素重组蛋白处理组； cGH+1000为lOOOng/mL鸡生长激素重组蛋白处理组;CG化1500为1500ng/mL鸡生长激素重组 蛋白处理组。经鸡生长激素重组蛋白处理后LMH细胞的IGF-I mRNA表达量明显提高，与对照 组相比呈极显著（P<〇.01)，表明本发明得到的鸡生长激素重组蛋白具有较高的生物学活 性。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1:构建鸡生长激素重组蛋白的重组表达载体和转基因重组酵母菌株
[0026] 1、从鸡垂体中得到CGH的基因片段
[0027] 从垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其CDNAsGenbank已公布的鸡生长激素 mRNA序列(NM_204359)设计引物，W上述得到的CDNA为模板，做PCR得到cGH基因的全长CDS 片段。把上述C細的基因片段插入到PMD19-T载体，命名为pMD19-T-cGH，并测序确定正确获 取目的基因。
[002引 2、构建pPIC9K-cGH重组表达载体
[0029] 根据鸡生长激素成熟多肤的基因序列设计引物，其中上游引物Pl带有NdeI酶切位 点，下游引物P2带有趾Ol酶切位点：根据pET-30a-c(iH重组载体中化S标签序列设计上游引 物P3带有EcoRI酶切位点，下游引物P4带有NotI酶切位点。
[0030] Pl:5 ' 一ATcatatgACCTTCCCTGCCATGC-3 '
[0031] P2:5，一ATctcgagGATGGTGCAGTTGCTCTC-3，
[0032] P3:5 ' _ATgaattcACCTTCCCTGCCATGC_3 '
[0033] P4 ： 5' -ATgcggccgcTTAGCAGCCGGATCTCA-3'
[0034] Wl中PMD19-T-C細质粒为模板，用P1、P巧I物进行PCR扩增。
[0035] PCR 体系：<