，探针上的氨基与尼龙膜表面的簇基发生交联反应； e .待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的化OH泡膜5分钟，W封闭尼龙膜表面未反应的簇 基； f.纯水洗涂尼龙膜，干燥后备用。 「nrvif；1 击 1
化：M代衣天父概测你订，IN代衣化巧巧照你衣不化巧巧照你 fTiZZb/ 1229N(图1-8中同理）。
[0046]根据本发明待检的20个突变位点的位置关系，我们设计了 10对引物分别进行扩 增，引物序列如表2所示。 r00471 要9
其中，HL1F、HL2F、HL3F、HL4F、HL5F、HL6F、HL7F、HL8F、HL9F、HL1OF是上游引物；HL1R、 化23、化31?、化41?、化51?、化61?、化71?、化81?、化91?、化101?是下游引物；该表中，引物化1尸和化1尺 扩增GJB2基因的CDNA35、cDNA176、CDNA176-191、CDNA235、cDNA299-300位点，引物HL2F和 HL2R扩增GJB3基因的cDNA538、cDNA547位点，引物HL3F和HL3R扩增12S rRNA基因的 cDNA1555、cDNA1494位点，引物HL4F和HL4R扩增化C26A4基因的281位点，引物HL5F和HL5R扩 增化C26A4基因的589位点，引物化6F和化6R扩增化C26A4基因的IVS7-2位点，引物化7F和 HL7R扩增化C26A4基因的1174、1226、1229位点，引物HL8F和HL8R扩增化C26A4基因的IVS15+ 5位点，引物化9F和化9R扩增SLC26A4基因的1975、2027位点，引物化IOF和HLlOR扩增 SLC26A4基因的 2162、2168位点。
[0048] 上游引物和/或下游引物的5'端带有生物素或巧光素（如切3、切5等)标记。本发明 实施例为对下游引物(化1R、化 2R、HL3R、HL4R、HL5R、HL6R、HL7R、HL8R、HL9R、HL10R)进行生 物素标记，其PCR扩增后的产物可与本发明实施例中的探针杂交。
[0049] 2、DNA提取和PCR扩增 2.1、 提取模板DNA:使用其它商业化试剂盒从病人的血液中提取模板DNA。
[0050] 2.2、合成10条引物:合成的方法为现有的常规的DNA合成法。
[0051] 2.3、配制PCR反应液:配制成25化/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成 份及浓度分别为：10条引物浓度分别为0.2皿ol/L、Taq酶为0. lU/化、1 XPCR Buffer、MgCl2 为 1.5mmol/L、dNTP为0.2mmol/L、模板DNA I~lOng/化。
[0化2] 2.4、PCR扩增:PCR扩增的反应程序为:95°C预变性5分钟;95°C变性30秒，55°C复性 30秒，72°C °C延伸45秒，循环35次；72°C再延伸5分钟。PCR扩增后的产物包含待测病人的 DNA片段。
[0化3] 3、杂交及显色 3.1. 杂交 将PCR扩增后的产物与步骤2中的尼龙膜条加入到12mL的杂交液(2 X SSC、0.1%SDS， 抑7.4)中，在杂交箱中42°C杂交2~4小时W上。
[0054] 3.2.洗膜 将尼龙膜条转移到预热至42°C的洗液(0.5 X SSC、0.1%SDS，pH7.4)中，于42°C洗涂15分 钟。
[0055] C.过氧化物酶(Peroxidase,缩略词为POD)解育 将膜条放入新鲜配制的0.25U/mL的链霉亲合素-P0D(str巧tin-POD)溶液中，37°C解育 15分钟，使链霉亲合素与PCR产物中的生物素结合，POD连接到PCR产物上，洗去多余的 Streptin-PODo [00日6] d.显色 现配显色液(0.1mol/L巧樣酸钢、0.1 mg/mL TMB、0.0015%此化），将膜条放入显色液中 避光显色15分钟，有杂交产物的膜条相应探针位置处会显蓝色斑点。
[0化7] 4、结果判断 4.1信号判断标准和依据 本产品采用人工观察的方式进行判读。通过探针位点上蓝色斑点的有无作为是否发生 杂交的定性判断依据，颜色的深浅不能作为定量判定依据。若个别位点有弱信号时，应与其 对应的对照点信号作对比，明显弱于对照信号时，应判为非特异信号;对应的对照位点不显 色或与对照位点信号相当时，应判为阳性信号。
[0化引4.2阴性判断依据 由于本产品是检测人基因突变的产品，即无论正常人还是发生了遗传性耳聋基因突变 的人，检测结果10个正常对照点都应该至少9个位点出现信号。产品规定：10个N位点均显色 阳性，20个M位点均为显色阴性，表示该样品结果为阴性，基因简写为N/N(如图1所示）。 [0化 9] 4.3阳性判断依据 在检测过程正常的前提下，任何M位点显色阳性都表示该样品为M位点类型的突变阳 性。
[0060] 见图1-8,若有一个突变位点显色，且其相应的正常位点和其他正常位点都显色， 则该样品可判断为突变杂合子，基因型简写为M/N，并在M前加上发生突变的位点（如图2所 示）。若有一个突变位点显色，且其相对应的正常位点不显色，则该样品可判断位突变纯合 子，基因型简写为M/M，并在两个M前都加上发生突变的位点（如图3-4所示）。若有两个突变 位点显色，且其相对应的两个正常位点也都显色，则该样品可判断为双重突变杂合子，基因 型简写为M/M，并在两个M前分别加上两个突变位点(不分先后）（如图5-6所示）。若有一个突 变位点显色，且所有正常位点都显色，但是运个位点没有设置正常探针，则须根据其双亲的 基因型，或者将该样本的测序结果，判断该患者为杂合突变还是纯合突变(如图7-8所示）。
[0061] 本发明实施例中的W上所述5种情况为绝大多数病例可能出现的情况，若结果超 出上述4种情况，在确认实验操作无误的情况下，应每个病例具体分析结果。
[0062] 针对中国人中最常见的20种遗传性非综合征耳聋基因突变类型，通过将含有20种 遗传性非综合征耳聋基因突变位点的突变检测探针固定在膜条上，与待检者相应片段的 PCR产物杂交，可同时检测导致遗传性非综合征耳聋的35delG、167delT、176-191dell6、 235delC、299-300delAT、538C〉T、547G〉A、1555A〉G、1494C〉T、281C〉T、589G〉A、IVS7-2A〉G、 1174A〉T、1226G〉A、1229C〉T、IVS15+5G〉A、1975G〉C、2027T〉A、2162C〉T、2168A〉G运20 种突变 类型。本发明是基于PCR-膜条杂交技术的基因检测方法，能直接对待检者的基因型进行确 诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。因此，应在婚检或孕检中使用 该方法对准父母进行基因检测，然后根据情况，必要时对胎儿进行产前检测，运样就可W大 大减少遗传性非综合征耳聋患儿的出生。
[0063] 最后应当说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。
【主权项】
1. 一种非综合征耳聋的基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探 针和特异性的突变检测探针，其特征在于:共包括用于检测20个基因突变位点的20条突变 检测探针和10条正常对照探针，所述20个基因突变位点分别为35(^16、167(1611'、176-191dell6、235delC、299-300delAT、538C>T、547G>A、1555A>G、1494C>T、281C>T、589G>A、 IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A〉 G〇2. 根据权利要求1所述的一种非综合征耳聋的基因检测膜条，其特征在于:所述20条突 变检测探针分别为：1761、2351、2991、5381、351 1497]?、15551、1￥57-21、21681、167]\1、281]\1、 1174]?、12291、19751、21621、547]\1、5891、12261、1￥515+51和2027]\1，所述20条突变检测探针 的3 '端或5 '端均带有氨基标记。3. 根据权利要求2所述的一种非综合征耳聋的基因检测膜条，其特征在于:所述突变检 测探针的具体序列分别为： 35M